本发明涉及生物工程
技术领域：
，具体而言，涉及甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用。
背景技术：
：有机磷化合物如对硫磷和甲基对硫磷是人类中枢神经系统中乙酰胆碱酯酶的强烈抑制剂，其摄入会导致神经系统功能的逐步丧失，甚至导致死亡，是一类高毒的化合物。但这类化合物在世界范围内仍然被广泛用来控制农业虫害。食品和环境中的有机磷农药残留给人类的生命健康造成了巨大的威胁。有机磷农药降解酶可以高效的水解有机磷农药，生成低毒的小分子化合物，本身无毒无害，为解决食品和环境中农药残留问题提供了一条安全绿色的途径。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体具有较好的有机磷化合物水解能力，能够应用于环境污染治理中。本发明的第二目的在于提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，该编码基因能编码上述的用于降解有机磷化合物的甲基对硫磷酸水解酶突变体。本发明的第三目的在于提供含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。本发明的第四目的在于提供含有上述甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。本发明的第五目的在于提供上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。本发明的第六目的在于提供上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：甲基对硫磷酸水解酶突变体，与seqidno.1所示的序列相比，甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a中的至少一种。一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因编码上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过提供甲基对硫磷酸水解酶突变体具有较高的酶活力，通过甲基对硫磷酸水解酶突变体较好的酶活，提高了对有机磷化合物的降解能力，不同的突变类型的酶活力具有不同程度的提高，具有好的工业应用前景和社会及经济价值。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实验例提供的野生型mph的产酶能力时间诱导曲线图；图2为本发明实验例提供的突变型mph产酶能力时间诱导曲线图。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。kod-plus-neo高保真pcr酶购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。内切酶，连接酶及t4polynucleotidekinase购自thermofisherscientific公司。zeocin与bradford试剂为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。琼脂糖凝胶dna回收试剂盒与质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。底物甲基对硫磷标品购自北京坛墨质检科技有限公司。llb(低盐lb)培养基用于培养大肠杆菌(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，0.5％nacl)、ypd培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)用于培养毕赤酵母。ypg培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油)用于bmmy培养基诱导前毕赤酵母增菌。bmmy培养基(1％酵母膏，2％蛋白胨，100mm磷酸钾缓冲液，ph6.0，1.34％ynb，4×10-5％biotin，0.5％甲醇)用于毕赤酵母摇瓶诱导产酶。bsm培养基(85％磷酸26.7ml/l，硫酸钙0.93g/l，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g/l，氢氧化钾4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l)用于发酵罐毕赤酵母产酶。下面对本发明实施例的甲基对硫磷酸水解酶突变体及编码基因、表达载体和菌株与应用进行具体说明。甲基对硫磷水解酶(mph)为目前文献报道比活力较高的有机磷水解酶，其对甲基对硫磷的水解活力可达到50.5u/mg。进一步提高mph的催化效率，对于降低其生产成本，促进其大规模的工业化应用具有重要意义。目前已经有一系列通过定向进化或理性设计的方法对mph进行改造以提高其催化效率的案例。甲基对硫磷酸水解酶突变体，与seqidno.1所示的序列相比，甲基对硫磷酸水解酶突变体具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a中的至少一种。进一步地，在本发明较佳的实施例中，优选地，包括对应seqidno.1所示的序列的第82位突变g82q或第118位突变v118a。进一步地，在本发明较佳的实施例中，优选地，包括对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c和第119位突变g119c。进一步地，在本发明较佳的实施例中，优选地，包括对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a。一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因编码上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的表达载体。将含有甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因通过基因工程的算克隆到表达载体，可以通过表达载体大量表达获得较多的具有较高有机磷化合物降解能力的甲基对硫磷酸水解酶突变体。避免自然菌种表达的效率低下的问题。含有上述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因的重组菌。进一步地，在本发明较佳的实施例中，重组菌的宿主菌为酵母菌。进一步地，在本发明较佳的实施例中，述的甲基对硫磷酸水解酶突变体在有机磷化合物降解中的应用。进一步地，在本发明较佳的实施例中，述的甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因在有机磷化合物降解中的应用。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体与seqidno.1所示的序列相比，具有对应seqidno.1所示的序列的第82位突变g82q或第118位突变v118a。本实施例还提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，编码基因编码具有对应seqidno.1所示的序列的第82位突变g82q的甲基对硫磷酸水解酶突变体。或者编码基因编码具有对应seqidno.1所示的序列的第118位突变v118a的甲基对硫磷酸水解酶突变体。本发明实施例还提供一种编码具有对应seqidno.1所示的序列的第82位突变g82q或第118位突变v118a的甲基对硫磷酸水解酶突变体的表达载体与重组菌。表达载体的构建，构架表达载体以含有编码野生型甲基对硫磷酸水解酶基因的重组质粒ppiczαa-ost1-mph为模板，以mphg82qf:caacttttcggccccaccctgggccggctggc和mphg82qr:ggccgcgccggtgtccaccagcacca为引物；引入具有对应seqidno.1所示的序列的第82位突变g82q；包括以下具体步骤：1.1用kod-plus-neo高保真pcr酶进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性2min，然后98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸4min，33个循环后，68℃保温7min；1.2使用dpni去除模板质粒ppiczαa-ost1-mph，进行琼脂糖凝胶电泳纯化；1.3得到g82q突变片段，t4polynucleotidekinase磷酸化g82q突变片段；1.4将g82q突变片段环化连接，得到g82q突变载体；1.5将g82q突变载体转化大肠杆菌dh5α，并涂布于25μg/ml的zeocin的llb平板，得到抗zeocin的转化子；1.6对转化子进行质粒小提；1.7测序确认突变正确后，大提质粒并使用saci进行线性化后转化毕赤酵母x33；1.8涂布于100μg/ml的zeocin的ypds平板获得毕赤酵母转化子(x33-ost1-mph(g82q))。经过ypg-bmmy摇瓶诱导，以甲基对硫磷为底物测定酶活力。当然，提取的重组质粒也可以转化到其他类型的宿主细胞中，形成重组细胞，进行蛋白的表达。同理，第118位突变v118a的载体构建方法与第82位突变g82q的甲基对硫磷酸水解酶突变体的构建方法一样；mphv118af:gctgggggcttgatggtgggtgagcaactggc和mphv118ar:gtggtcggggtgcatgtgggtgatgt为引物。得到重组酵母菌x33-ost1-mph(v118a)。实施例2本实施例提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体与seqidno.1所示的序列相比，具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c和第119位突变g119c。本实施例还提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，编码基因编码具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c和第119位突变g119c的甲基对硫磷酸水解酶突变体。本发明实施例还提供一种编码具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c和第119位突变g119c的甲基对硫磷酸水解酶突变体的表达载体与重组菌。表达载体的构建，构架表达载体以含有编码野生型甲基对硫磷酸水解酶基因的重组质粒ppiczαa-ost1-mph为模板，以mphl83cf:tgtttcggccccaccctgggccggctggc和mphl83cr:ggccgcgccggtgtccaccagcacca为引物；引入具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c；然后再用mphg119cf:tgtggcttgatggtgggtgagcaactggc和mphg119cr:gtggtcggggtgcatgtgggtgatgt为引物引入第119位突变g119c，获得包括第83位突变l83c和第119位突变g119c的甲基对硫磷酸水解酶突变体；具体包括以下具体步骤：2.1用kod-plus-neo高保真pcr酶进行pcr扩增，扩增条件为：94℃预变性2min，然后98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸4min，33个循环后，68℃保温7min；2.2使用dpni去除模板质粒ppiczαa-ost1-mph，进行琼脂糖凝胶电泳纯化；2.3得到l83c突变片段，t4polynucleotidekinase磷酸化l83c突变片段；2.4将l83c突变片段环化连接，得到l83c突变载体；2.5将l83c突变载体转化大肠杆菌dh5α，并涂布于25μg/ml的zeocin的llb平板，得到抗zeocin的转化子；2.6对转化子进行质粒小提，测序确认正确后以测序确认正确的质粒为模板，以mphg119cf和mphg119cr引物扩增，重复2.1-2.5的步骤，小提质粒测序确认正确后得到l83c-g119c突变载体；2.7大提l83c-g119c质粒并使用saci进行线性化后转化毕赤酵母x33；2.8涂布于100μg/ml的zeocin的ypds平板获得毕赤酵母转化子(x33-ost1-mph(l83c，g119c))。经过ypg-bmmy摇瓶诱导，以甲基对硫磷为底物测定酶活力。当然，提取的重组质粒也可以转化到其他类型的宿主细胞中，形成重组细胞，进行蛋白的表达。实施例3本实施例提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体，该甲基对硫磷酸水解酶突变体与seqidno.1所示的序列相比，具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a。本实施例还提供一种甲基对硫磷酸水解酶突变体的编码基因，编码基因编码具有对应seqidno.1所示的序列的第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a的甲基对硫磷酸水解酶突变体。表达载体的构建，构架表达载体以含有编码野生型甲基对硫磷酸水解酶基因的重组质粒ppiczαa-ost1-mph为模板，以mphl83c(q)f:caatgtttcggccccaccctgggccggctggc和mphl83c(q)r:ggccgcgccggtgtccaccagcacca为第一步的引物，引入第82位突变g82q和第83位突变l83c；以mphg119c(a)f:gcttgtggcttgatggtgggtgagcaactggc和mphg119c(a)r:gtggtcggggtgcatgtgggtgatgt为第二步引物，引入第118位突变v118a和第119位突变g119c，获得包括第83位突变l83c、第119位突变g119c、第82位突变g82q和第118位突变v118a的甲基对硫磷酸水解酶突变体；具体构建步骤与实施例1-2中相同。实施例4本实施例提供对实施例1到实施例3构建的表达载体以及获得重组菌进行培养表达甲基对硫磷酸水解酶突变体，并测定其酶活。活力检测采用测定对硝基苯酚的生成速率法，具体方法如下：先向试管中加入3160ml0.1mph9.5的tris-hcl缓冲液和40ml10mm甲基对硫磷甲醇溶液，混匀后于25℃水浴预热5min,再加入80ml酶稀释液后即刻混匀并开始计时，依次记录第30s405nm吸光度a1和第90s405nm吸光度a2。注意适当稀释原酶液以控制30s吸光值a1落在0.15-0.25可信区间范围之内。同一样品做两个平行，两个平行测定值的相对误差不超过10.0％，二者的平均值为最终的酶活力测定值。酶活力按照下列公式计算：式中：x-样品中甲基对硫磷水解酶mph的活力，u/ml；vt-反应总体积(3280μl)；vs-样品体积(80μl)；17.7-对硝基苯酚在405nm的摩尔消光系数(cm2/mmol)；1.0-光径(cm)；δa-90s与30s405nm吸光度差(a2-a1)；n-稀释倍数；t-反应时间(1min)。mph酶活力定义为：在25℃和ph9.5的条件下，以0.125mm甲基对硫磷为底物，每分钟产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位。采用硫酸铵分级沉淀法对x33-ost1-mph(g82q)，x33-ost1-mph(v118a)，x33-ost1-mph(l83c，g119c)，x33-ost1-mph(l83c，g119c，g82q，v118a)与x33-ost1-mph摇瓶诱导上清液进行纯化，得到了电泳纯的四种突变型mph与野生型mph。使用bradford试剂标定突变型mph与野生型mph蛋白浓度并测定甲基对硫磷水解酶活力发现，野生型mph比活力仅为48.3u/mg，而mph(g82q)，mph(v118a)，mph(l83c，g119c)，mph(l83c，g119c，g82q，v118a)的比活力分别为72.5u/mg，58.0u/mg，86.9u/mg和115.9u/mg，是野生型mph的1.5，1.2，1.8和2.4倍。同时对四种突变型mph和野生型mph进行热稳定性考察，具体的热稳定性结果如表1所示。表1热稳定性结果酶种比活力(u/mg)45℃温育30min酶活损失率(％)野生型mph48.346.9mph(g82q)72.545.3mph(v118a)58.046.2mph(l83c，g119c)86.943.1mph(l83c，g119c，g82q，v118a)115.942.2从表1可以看出，对突变型mph与野生型mph进行热稳定性考察发现，突变型mph与野生型mph的热稳定性相似。两者在40℃条件下温育30min酶活力基本无损失。在45℃条件下温育30min，mph(g82q)，mph(v118a)，mph(l83c，g119c)和mph(l83c，g119c，g82q，v118a)的酶活损失率为45.3％，46.2％，43.1％和42.2％，野生型mph酶活损失率为46.9％，损失率相近。实施例5本实施例通过发酵罐的发酵实验，验证表达四点突变的甲基对硫磷水解酶突变体的酵母重组菌x33-ost1-mph(l83c，g119c，g82q，v118a)与表达野生型甲基对硫磷水解酶的重组酵母菌x33-ost1-mph的产酶能力和酶活的变化。x33-ost1-mph(l83c，g119c，g82q，v118a)与x33-ost1-mph的30l发酵罐小试按照invitrogen公司的pichiafermentationprocessguidelines操作手册操作，具体方法如下：5.1在30l发酵罐初始装液量15l，采用bsm培养基，配方为400.5ml85％磷酸，13.95g硫酸钙，273g硫酸钾，223.5g七水硫酸镁，61.95g氢氧化钾，600g甘油，自来水定容到15l；5.2在121℃温度下，灭菌30min冷却后，加入ptm1微量元素溶液65.25ml；5.3接入5％-10％摇瓶菌种控温28℃，在ph＝4.8条件下发酵。通过控制通风量及转速控制溶氧始终大于20％；5.4待底料中甘油耗尽，溶氧反弹后开始流加25％甘油5l(加有60mlptm1)；5.5待流加结束，溶氧反弹，饥饿半小时后开始流加100％甲醇(混有12ml/l的ptm1)，流加速率从30g/h逐步增加到80g/h，每隔一定时间取样检测酶活。实验结果如图1和图2所示，图1表示野生型菌株的产酶曲线，野生型菌株最高酶活力出现在诱导后72h，为1663u/ml；图2表示表达甲基对硫磷水解酶四点突变体的重组酵母菌x33-ost1-mph(l83c，g119c，g82q，v118a)的产酶曲线，从图中可以看出，突变型菌株在诱导3h即可产生136u/ml的酶活力，随后酶活呈线性增长，在54h达到最大值3202u/ml，是野生型菌株的1.9倍。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12