本发明涉及一种新型葡聚三糖及其多酶法制备方法，尤其是利用葡萄糖和蔗糖为原料，采用多酶法制备聚合度为3的新型葡聚糖的方法，属于食品生物技术领域。
背景技术：
新型葡聚三糖是由葡萄糖单元组成。是葡萄糖单元通过α-1,2-吡喃葡萄糖苷键和α-1,6-吡喃葡萄糖苷键连接而成。目前，国内外对该新型葡聚三糖鲜有报道，而该新型葡聚三糖具有低热量、抗人体消化道降解功能，可作为潜在的益生元用于食品、药品等行业中，具有良好的应用前景。
蔗糖磷酸化酶是gh13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶，催化1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体。当以蔗糖为供体，以葡萄糖为受体时，蔗糖磷酸化酶催化生成曲二糖，该二糖是是葡萄糖单元通过α-1,2-吡喃葡萄糖苷键连接而成。
交替糖蔗糖酶是gh70家族中的一员，具有转苷活性，是葡聚糖蔗糖酶的一种。当反应底物只有蔗糖存在时发生聚合反应生成交替糖多糖。当反应底物中存在蔗糖和另一种可以与酶连接的单糖或双糖时，酶催化两种糖生成小分子的低聚糖。交替蔗糖酶发生受体反应时可以形成α-1,3糖苷键也可以形成α-1,6糖苷键，当受体不含α-1,6糖苷键时，优先形成α-1,6糖苷键。此外，由于受体分子不同于蔗糖分子，因而受体分子攻击葡糖基或葡聚糖基后终止葡聚糖链的形成而生成聚合度较低的寡糖。
技术实现要素：
本发明旨在制备一种新型葡聚三糖，所要解决的技术问题是提供以葡萄糖和蔗糖为原料，利用蔗糖磷酸化酶和交替糖蔗糖酶进行酶催化反应制备新型葡聚三糖的方法。
本发明的技术方案是以葡萄糖和蔗糖为原料的多酶促反应。
所述多酶促反应的条件是：
(1)制备曲二糖：以0.1～1m蔗糖和0.1～1m葡萄糖为底物，加入0.1～100u/ml蔗糖磷酸化酶，在30～70℃水浴摇床，转速100～300r/min，反应20～50h，加热1～20min终止反应，生成曲二糖；
(2)制备新型葡聚三糖：向步骤(1)所得反应液中依次加入1～30％蔗糖和0.1～100u/ml交替糖蔗糖酶，在30～70℃水浴摇床，转速100～300rpm，反应20～50h，随后沸水浴加热1～20min终止反应。
在本发明的一种实施方式中，所述酶类包括蔗糖磷酸化酶和交替糖蔗糖酶。
在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶为bifidobacteriumadolescentis来源。
在本发明的一种实施方式中，所述交替糖蔗糖酶为leuconostoccitreum来源。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)制备曲二糖：以0.1～1m蔗糖和0.1～1m葡萄糖为底物，加入0.1～0.25u/ml蔗糖磷酸化酶，在30～50℃水浴摇床，转速100～300r/min，反应20～36h，加热1～20min终止反应，生成曲二糖.
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)制备曲二糖：以0.5m蔗糖和0.5m葡萄糖为底物，加入0.25u/ml的蔗糖磷酸化酶，在50℃水浴摇床、转速150r/min条件下，反应36h后，加热5min终止反应。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中，向步骤(1)所得反应液中依次加入1～10％蔗糖和0.1～5u/ml交替糖蔗糖酶，在40～50℃水浴摇床，转速100～300rpm，反应20～36h，随后沸水浴加热1～20min终止反应。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)制备新型葡聚三糖：向步骤(1)所得反应液中依次加入10％蔗糖和5u/g交替糖蔗糖酶，在40℃水浴摇床、转速150rpm条件下，反应34h后，加热5min终止反应。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)制备新型葡聚三糖反应结束后，离心收集上清液，即得到含有新型葡聚三糖的溶液。
本发明以来源广泛、采购方便、便于运输、价格廉价的葡萄糖和蔗糖为原料，通过蔗糖磷酸化酶和交替糖蔗糖酶先后催化反应46h时，底物转化率达62.4％，制备具有极大潜在用途的新型葡聚三糖，为工业生产提供较大的升值空间和生产收益。
附图说明
图1是实施例1中制备曲二糖的反应结束后样品的hplc图谱。
图2是实施例1中制备新型葡聚三糖的反应结束后样品的hplc图谱。
具体实施方式
蔗糖磷酸化酶酶活测定方法：将1ml5％的蔗糖溶液和0.9ml的50mmol/l，ph6.7的磷酸缓冲液充分混匀，在55℃预热10min,加入100ul的酶液，反应10min后加入3mldns，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。
蔗糖磷酸化酶酶活定义：将每分钟水解蔗糖糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(u)。
交替糖蔗糖酶酶活测定方法：将待测酶液在45℃下保温30min，取0.4ml加入到3.6ml蔗糖naac-hac缓冲溶液(50mmol/l，ph5.4)中，使蔗糖最终浓度为10％，在40℃预热10min，加入100ul的酶液，反应30min后加入3mldns，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度。
交替糖蔗糖酶酶活定义：将每分钟水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(u)。
产物的hplc检测：最终反应体系中的蔗糖、葡萄糖、果糖、曲二糖的量采用hplc来确定。色谱条件为：agilent1200hplc色谱仪，agilent自动进样器，色谱柱nh2-504e(4.6mm×250mm)，示差检测器为安捷伦g1362a；流动相采用75％(v/v)乙腈和水的混合溶液，流速为0.8ml/min，柱温设定为35℃。采用外标法，根据保留时间和峰面积确定相应交替糖寡糖的浓度。
新型葡聚三糖的转苷效率d的计算公式为：
d(％)＝[1-(m1/m2)]*100％
其中d：蔗糖转化为新型葡聚三糖的摩尔转化率(％)；
m1：酶转化反应中未反应的曲二糖的摩尔数(mol)；
m2：投入到反应液中的蔗糖的摩尔数(mol)。
实施例1多酶法制备新型葡聚三糖
在50ml的密闭的容器中进行10ml的酶转化体系。先后利用蔗糖磷酸化酶和交替糖蔗糖酶制备交替糖寡糖，步骤如下：
制备曲二糖：以0.5m蔗糖和0.5m葡萄糖为底物，加入0.25u/mol蔗糖磷酸化酶。在50℃水浴摇床，ph5.4，转速150r/min，反应36h。加热5min终止反应，取样，通过hplc分析产物，计算生成的曲二糖的量，色谱峰见图1
制备新型葡聚三糖：在上述反应液中依次加入10％蔗糖和5u/g交替糖蔗糖酶，在40℃水浴摇床，ph5.4，转速150rpm，反应34h。随后沸水浴加热5min终止反应，反应液离心，通过hplc分析产物。当反应结束后计算转化率为62.4％，色谱峰见图2。
实施例2
采用实施例1相同的策略制备新型葡聚三糖，区别在于，加入100u/g交替糖蔗糖酶制备新型葡聚三糖，通过hplc分析产物，转化率为62.9％，与加入5u/g交替糖蔗糖酶相比，转化率基本相同。
实施例3
采用实施例1相同的策略制备新型葡聚三糖，区别在于，制备曲二糖的步骤的反应时间调整为24h，通过hplc分析产物，转化率为48.8％，明显低于反应时间36h的转化率。
实施例4
采用实施例1相同的策略制备新型葡聚三糖，区别在于，将制备新型葡聚三糖步骤中的ph条件调整为6.0，通过hplc分析产物，转化率为54.1％。在交替糖蔗糖酶催化合成新型葡聚三糖的反应过程中，反应体系的ph会影响反应产物新型葡聚三糖的产量。可见，与ph5.4相比，ph6.0时，新型葡聚三糖产量下降。
实施例5
采用实施例1相同的策略制备新型葡聚三糖，区别在于，将制备新型葡聚三糖这一步骤的反应温度调整为30℃，通过hplc分析产物，转化率为51.6％，明显低于反应温度为40℃的转化率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。