本发明涉及使用生物合成工艺和特定的酶促工艺制造l-甲硫氨酸的方法。更特别地，本发明涉及在甲硫醇(ch3sh)的存在下由l-甲硫氨酸前体通过酶转化反应以高产率制造l-甲硫氨酸的方法。本发明的制造l-甲硫氨酸的方法是比现有技术已知的常规方法更环境友好的，且使得能够选择性制造l-甲硫氨酸，其可用在各种工业领域中，例如饲料和食品添加剂、用于医疗用品、药物的原料等。
背景技术：
甲硫氨酸是人体的必须氨基酸之一，且已经广泛地用作饲料和食品添加剂并进一步用作用于医用溶液、医疗用品以及药物的合成原料。甲硫氨酸作为如胆碱(卵磷脂)和肌酸这样的化合物的前体且同时用作用于半胱氨酸和牛磺酸的合成原料。甲硫氨酸还可提供硫。
s-腺苷-l-甲硫氨酸源自甲硫氨酸，并在人体中提供甲基方面发挥一定的作用，而且还涉及在脑中各种神经递质的合成。l-甲硫氨酸(l-met)和/或s-腺苷-l-甲硫氨酸(sam)抑制在肝脏和动脉中的脂肪积累，促进脂质代谢。其还改善在脑、心脏和肾脏中的血液循环，和因此用作用于减轻炎症、肌肉疼痛和肝脏疾病的抗抑制剂(anti-depressionagent)，尤其在由酒精造成的肝脏疾病中是有效的。
其还可用于促进有毒物质的消化、解毒和排泄以及重金属如铅的排泄。其具有对于骨和关节疾病的抗炎作用并促进关节恢复，且还作为头发的必须营养素，由此防止掉发。
已知甲硫氨酸根据化学和/或生物合成制备，这已经是许多工作和研究的主题，主要目标在于提出更有效、更选择性和更环境友好的制备方法。
在化学合成中，甲硫氨酸主要通过5-(β-甲基巯基乙基)乙内酰脲的水解制造。化学合成的甲硫氨酸具有仅以l-型和d-型的混合形式制造的缺点。
在生物合成中，甲硫氨酸通过使用在甲硫氨酸合成中涉及的蛋白质的方法制造。l-甲硫氨酸通过由多种基因如meta、metb、metc、mete和meth表达的酶的作用从高丝氨酸生物合成。特别地，meta是编码作为甲硫氨酸生物合成必须的第一酶的高丝氨酸-o-琥珀酰基转移酶的基因，且其将高丝氨酸转化成o-琥珀酰基-l-高丝氨酸。通过metb基因编码的o-琥珀酰基高丝氨酸裂合酶或胱硫醚-γ-合酶将o-琥珀酰基-l-高丝氨酸转化成胱硫醚。
通过metc基因编码的胱硫醚-β-裂合酶将胱硫醚转化成l-高半胱氨酸。mete编码钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶且meth编码钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶，这两者将l-高半胱氨酸转化成l-甲硫氨酸。此时，由metf编码的5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶和由glya编码的丝氨酸羟甲基转移酶一起工作以合成n(5)-甲基四氢叶酸，其提供l-甲硫氨酸合成必需的甲基。l-甲硫氨酸通过由上述酶的一系列有机反应合成。
通过常规生物方法制造的甲硫氨酸是l-型的，其具有优点但是产量太小。这是因为甲硫氨酸的生物合成路线具有非常紧凑的(tight)反馈调节系统。一旦甲硫氨酸合成到一定水平，最终产物甲硫氨酸抑制meta基因的转录，所述meta基因编码用于引发甲硫氨酸生物合成的第一蛋白质。meta基因本身的过表达不能增加甲硫氨酸的产量，因为meta基因在转录阶段被甲硫氨酸抑制且在翻译阶段被细胞内蛋白酶降解。
常规的甲硫氨酸生物合成方法使用胱硫醚合酶代谢路径以制造甲硫氨酸，因此由于硫化物毒性和副产物的产生，酶反应过程是效率低的。另外，甲硫氨酸合成路径中的反馈调节抑制甲硫氨酸的大量生产。
克服上述问题的制造l-甲硫氨酸的替代方法公开在以序号wo2008/013432公开的国际申请中。该替代方法由两步法构成，其中通过发酵制造l-甲硫氨酸前体和将l-甲硫氨酸前体通过酶选择性地转化为l-甲硫氨酸。
更准确地，wo2008/013432公开了包括如下步骤的制造l-甲硫氨酸的方法：1)制备产生l-甲硫氨酸前体的菌株并通过所述菌株的发酵制造l-甲硫氨酸前体；和2)使用所述l-甲硫氨酸前体通过酶反应产生l-甲硫氨酸和有机酸。
步骤2)过程包括通过使用由以上产生l-甲硫氨酸前体的菌株产生的o-琥珀酰基高丝氨酸或o-乙酰基高丝氨酸以及甲硫醇作为底物使用具有胱硫醚合酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶或包含这些酶活性的菌株通过酶反应产生l-甲硫氨酸和有机酸的过程。
wo2008/013432提供对步骤2)的大体信息，其在于在甲硫醇的存在下通过酶反应将l-甲硫氨酸前体转化为l-甲硫氨酸。
即使l-甲硫氨酸的总产率是满意的，但是仍然存在对如下的需要：甚至更加改善l-甲硫氨酸的生物合成，尤其是改善l-甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化步骤以特别地以改善的产率获得l-甲硫氨酸。
技术实现要素：
因此，本发明的第一目标是提供l-甲硫氨酸前体与甲硫醇的酶促转化以改善的产率获得l-甲硫氨酸的改善的方法。
更特别地，本发明提供通过l-甲硫氨酸前体和甲硫醇的酶反应产生l-甲硫氨酸的方法。
在本发明的方法中，l-甲硫氨酸前体可为现有技术中已知的任意前体，其能够通过与甲硫醇的酶反应转化为l-甲硫氨酸，且例如wo2008/013432中公开的。根据本发明的优选方面，通过使用作为底物积累的高丝氨酸、o-磷酰基-高丝氨酸、o-琥珀酰基高丝氨酸或o-乙酰基高丝氨酸，用于转化l-甲硫氨酸的酶优选选自胱硫醚合酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶。
更优选地，用在本发明的方法中的l-甲硫氨酸前体选自o-琥珀酰基高丝氨酸(osh)和o-乙酰基高丝氨酸(oah)。还更优选地，l-甲硫氨酸前体是oah。
在本发明的方法中，当将o-乙酰基高丝氨酸用作l-甲硫氨酸前体时，优选地，可使用优选源自钩端螺旋体属菌种(leptospirasp.)、色杆菌属菌种(chromobacteriumsp.)、或生丝单胞菌属菌种(hyphomonassp.)的胱硫醚-γ-合酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(oahs)，更优选源自迈氏钩端螺旋体(leptospirameyeri)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaurogenosa)、海王生丝单胞菌(hyphomonasneptunium)或紫色色杆菌(chromobacteriumviolaceum)的胱硫醚-γ-合酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶(oahs)。
本发明的酶反应过程可以如下流程表示：
o-琥珀酰基-l-高丝氨酸+ch3sh←→l-甲硫氨酸+琥珀酸根
o-乙酰基-l-高丝氨酸+ch3sh←→l-甲硫氨酸+乙酸根
其中该反应是酶促反应且以甲硫醇(ch3sh)的特定压力范围操作。
在上述反应中，甲硫醇的ch3s-残基被o-琥珀酰基高丝氨酸或o-乙酰基高丝氨酸的琥珀酸根或乙酸根残基取代以产生l-甲硫氨酸。根据本发明，将甲硫醇在精确的压力范围下加入，如本说明书中进一步解释的。
在甲硫醇的存在下将l-甲硫氨酸前体转化为l-甲硫氨酸的上述反应是酶促反应，例如wo2008/013432中公开的。
wo2008/013432提供了对可使用的酶的性质和制备的细节，所述酶是具有在甲硫醇的存在下将l-甲硫氨酸前体转化为l-甲硫氨酸的合适的活性的酶。这样的合适的酶可例如使用根据生物技术方法的基因表达制备。
作为非限制性实例，编码具有上述酶活性的酶的基因序列可从美国的ncbi数据库和日本的dna资料库(kegg)获得。
对于生物转化反应，从所获得的基因序列克隆基因，其随后被引入表达载体中。将酶从重组菌株以活性形式表达。表达酶的菌株和被表达的酶两者可直接用于所述反应。
从上述基因表达的酶或表达那些酶的微生物菌株可直接与积累有l-甲硫氨酸前体的发酵上清液或发酵液(部分地或不是部分地)混合以开始所述反应。在本发明的优选实施方式中，可将积累在发酵溶液中的o-琥珀酰基高丝氨酸或o-乙酰基高丝氨酸通过源自假单胞菌属菌种(pseudomonassp.)、色杆菌属菌种、钩端螺旋体属菌种或生丝单胞菌属菌种的胱硫醚-γ-合酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶转化成l-甲硫氨酸。
更优选地，可将积累在发酵溶液中的o-琥珀酰基高丝氨酸通过源自铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)或紫色色杆菌的胱硫醚-γ-合酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶转化成甲硫氨酸。将积累在发酵溶液中的o-乙酰基高丝氨酸通过源自迈氏钩端螺旋体、海王生丝单胞菌或紫色色杆菌的胱硫醚-γ-合酶或o-乙酰基高丝氨酸硫化氢解酶或o-琥珀酰基高丝氨酸硫化氢解酶转化成甲硫氨酸。
将各基因在pcl-cji载体(cj，korea)(用于大肠杆菌(e.coli)的表达载体)中表达，且从通过使用声处理的细胞裂解而制备的酶溶液获得被表达的蛋白质。将所述酶溶液加入到积累o-琥珀酰基高丝氨酸或o-乙酰基高丝氨酸的发酵溶液中，且还向其加入甲硫醇以开始反应。
使用dtnb[5,5-二硫双(2-硝基-苯甲酸，sigma，usa]证实所述反应，且通过hplc分析反应产物。在本发明中，通过甲硫醇分别与o-琥珀酰基高丝氨酸和o-乙酰基高丝氨酸的反应，可在没有单独的(separate)制造过程的情况下额外获得副产物例如琥珀酸或乙酸。
l-甲硫氨酸前体与ch3sh的酶促反应可通过如下流程说明：
如在上文中描述的，l-甲硫氨酸的前体的酶促转化如下进行：在甲硫醇(ch3sh)的存在下，且根据本发明在ch3sh压力下，更具体地使得反应介质上方的ch3sh分压在特定的压力范围内。
在wo2008/013432中描述的方法没有提供关于在甲硫醇的存在下l-甲硫氨酸前体到l-甲硫氨酸的该酶促转化的详细操作条件，特别地甲硫醇在没有对其施用方式的任何指示的情况下使用。也不存在l-甲硫氨酸前体的转化率的信息。
本发明人现在已经发现l-甲硫氨酸前体的转化率极大地取决于甲硫醇对反应介质且特别是对在用于该反应的转化反应容器中存在的ch3sh分压的施用方式。
更准确地，清楚地看出，在反应温度下从0到ch3sh饱和蒸气压存在薄窗，其中转化率从压力的有益效果向强的抑制效果转变。
因此，存在最优化的ch3sh分压范围，其中甲硫氨酸前体(如oahs)向甲硫氨酸的转化是最大的。本来会预期，ch3sh压力越高，溶液化的(溶解的，solubilized)ch3sh的量越大，因此转化反应的动力学越快且因此向甲硫氨酸的转化越高。
但是，已经观察到，还增加ch3sh分压对于所述转化是有害的。不受理论的束缚，对于该现象的一种解释可为太大的ch3sh压力导致太高量的ch3sh存在于反应介质中。该过量的ch3sh将阻挡酶的活性部位，且导致反应的抑制。因此，将存在反应动力学和达到酶的反应性部位之间的竞争。
根据本发明的方法，在反应介质上方的在反应容器中的最佳ch3sh分压范围为10kpa-180kpa、优选51kpa-180kpa、更优选51kpa-160kpa、还更优选约80kpa-约160kpa、有利地约90kpa-约150kpa，例如ch3sh分压为约100kpa-150kpa，在反应温度下。
这些特定的条件允许快的转化动力学以及高的l-甲硫氨酸前体转化率，例如在2小时的反应时间后可获得100％的转化率。
所述反应通常在适于l-甲硫氨酸前体到l-甲硫氨酸的酶促转化的适当温度下实施，例如wo2008/013432中公开的。有利地，反应温度范围为20℃-45℃、优选25℃-40℃、还更优选30℃-40℃。
更准确地，将甲硫醇经由汲取管引入反应器中到反应介质中。甲硫醇通过在外部甲硫醇容器上施加氮气压力而引入。甲硫醇的流速通过变化氮气压力和使用排气阀而控制。引入的甲硫醇的一部分溶解在反应介质中，而剩余部分为反应介质上方的气态形式。
反应中的甲硫醇的溶解性可通过将甲硫醇与二甲硫醚(dms)以合适的比率混合而增加。dms的使用改善l-甲硫氨酸和有机酸从l-甲硫氨酸前体的转化率、以及l-甲硫氨酸产生的产率。
优选地，当dms与甲硫醇混合时，甲硫醇/dms摩尔比范围为1:0.05-1:1、更优选1:0.20-1:1、还更优选1:0.25-约1:0.50。作为实例，dms可以约5％-25％、优选20％-25％的比率混合，相对于甲硫醇和dms的总和。
在将所需量的甲硫醇引入反应器中且达到液相和气相之间的平衡态之后，可加入或除去甲硫醇，反应介质上方的分压通过任意已知的方式如压力计检查。反应自始至终控制甲硫醇分压直到完成。
根据优选的实施方式，当引入化学计量时，停止甲硫醇的引入，且从该点开始，甲硫醇分压降低直到反应完成。
由于反应的酶促转化反应还导致酸性副产物，因此反应的ph可有利地控制和维持在约中性或稍微酸性值，优选反应介质的ph在转化的自始至终维持在6-7。
为了将ph值调节在6-7，可将一种或多种碱性化合物加入到反应介质，所述碱性化合物为含水的碱(水性碱)，如wo2008/013432中公开的，例如选自氢氧化铵、氢氧化钾、氨等，例如氨水溶液。
根据现有技术中的已知技术，转化反应还有利地在辅酶的存在下进行，例如wo2008/013432中公开的。这样的辅酶的实例为吡哆醛-5'-磷酸(plp)。
当实施本发明的方法时，将ch3sh分压设定到上面定义的优选值，l-甲硫氨酸前体的转化率比当ch3sh的分压在本发明的方法的范围之外时高至少10％-20％。在这些特定条件下，还可观察到l-甲硫氨酸前体转化率早在0.5小时后为大于80％，且在2小时的反应时间后甚至等于100％。
该特别快的完全转化率导致l-甲硫氨酸的总体(overall)制备，其中l-甲硫氨酸前体的酶促转化不是限制性步骤，且由此允许以比迄今为止现有技术中已知的那些大的高产率的l-甲硫氨酸的总体生物合成。
因此，本发明的第二方面涉及制备l-甲硫氨酸的方法，包括如下步骤：
1)制备产生l甲硫氨酸前体的菌株和通过所述菌株的发酵产生l-甲硫氨酸前体；
2)在处于10kpa-180kpa、优选50kpa-160kpa、更优选约80kpa-约150kpa分压的ch3sh的存在下通过酶反应将所述l-甲硫氨酸前体转化为l-甲硫氨酸；
3)收集获得的l-甲硫氨酸。
该l-甲硫氨酸的生物合成制备的总体方法可通过下列方案表示：
其中l-甲硫氨酸前体是oahs，从葡萄糖的发酵经由基因表达制备。
步骤1的发酵过程可为现有技术中已知的任意发酵过程，且例如wo2008/013432中公开的。
特别地，在所述方法的步骤1)中，使产生l-甲硫氨酸前体的菌株产生且发酵以在培养基中积累l-甲硫氨酸前体。
本发明的l-甲硫氨酸前体优选为o-乙酰基高丝氨酸或o-琥珀酰基高丝氨酸。如本文中使用的“产生l-甲硫氨酸前体的菌株”指原核或真核微生物菌株，其能够通过本发明的操作积累l-甲硫氨酸前体。
例如，所述菌株可选自埃希氏菌属菌种(escherichiasp.)、欧文氏菌属菌种(erwiniasp.)、沙雷氏菌属菌种(serratiasp.)、普罗威登斯菌属菌种(providenciasp.)、棒状杆菌属菌种(corynebacteriasp.)、假单胞菌属菌种、钩端螺旋体属菌种、沙门氏菌属菌种(salmonellarsp.)、短杆菌属菌种(brevibacteriasp.)、生丝单胞菌属菌种、色杆菌属菌种和诺卡氏菌属菌种(norcardiasp.)微生物或真菌或酵母。
优选地，假单胞菌属菌种、诺卡氏菌属菌种和埃希氏菌属菌种的微生物可用于产生o-琥珀酰基高丝氨酸，和埃希氏菌属菌种、棒状杆菌属菌种、钩端螺旋体属菌种(reptospirasp.)的微生物、和酵母可用于产生o-乙酰基高丝氨酸。更优选地，可使用埃希氏菌属菌种的微生物，且最优选可使用大肠杆菌(escherichiacoli)(下文中称为“e.coli”)。另外，可将外源基因引入到埃希氏菌属菌种微生物中以选择性产生o-琥珀酰基高丝氨酸和o-乙酰基高丝氨酸。
产生l-甲硫氨酸前体的菌株可从产生l-赖氨酸、l-苏氨酸或l-异亮氨酸的菌株制备。优选地，其可通过使用产生l-苏氨酸的菌株制备。使用该菌株，高丝氨酸合成已经是较高的且作为结果可增加甲硫氨酸前体的产生。
因此，甲硫氨酸前体可通过使用产生l-苏氨酸的菌株缺失或减弱在苏氨酸生物合成途径中涉及的基因和然后缺失或减弱meta或mety或metz基因而积累。更优选首先缺失或减弱thrb基因和然后缺失或减弱metb、mety或metz以合成甲硫氨酸前体。同时，meta或metx基因表达的增强导致甲硫氨酸前体合成的增加。
如本文中之前描述的，本发明的“产生l-苏氨酸的菌株”指能够体内产生l-苏氨酸的原核或真核微生物菌株。例如，所述菌株可包括属于埃希氏菌属菌种、欧文氏菌属菌种、沙雷氏菌属菌种、普罗威登斯菌属菌种、棒状杆菌属菌种和短杆菌属菌种的产生l-苏氨酸的微生物菌株。在这些中，埃希氏菌属菌种微生物是优选的，且大肠杆菌是更优选的。
产生l-苏氨酸的菌株不仅包括天然的微生物，而且还包括它们的突变体，以如下的微生物为例：所述微生物具有对于异亮氨酸的渗漏需要(leakyrequirement)且对l-赖氨酸类似物和α-氨基丁酸是抗性的；和是通过另外至少引入内源性磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因的额外拷贝而突变的；和是在作为l-甲硫氨酸合成为磷酸烯醇丙酮酸(pep)的中间体的草酰乙酸(酯)(oaa)的转化过程中涉及的失活的pcka基因；和是抑制在l-甲硫氨酸生物合成中涉及的tyrb基因表达的失活的tyrr基因；和是抑制在葡萄糖转运中涉及的galp基因表达的失活的galr基因。
本文中的l-赖氨酸类似物可为选自s-(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸和δ-甲基-l-赖氨酸的一种或多种化合物。在本发明的优选实施方式中，使用cjm002(从tf4076(kfcc10718，韩国专利92-8365)突变的产生l-苏氨酸且l-甲硫氨酸非依赖性的菌株)，tf4076为产生l-苏氨酸的大肠杆菌突变体菌株。tf4076具有对于甲硫氨酸的需求，且对甲硫氨酸类似物(如α-氨基-β-羟基戊酸，ahv)、赖氨酸类似物(如s-(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸，aec)和异亮氨酸类似物(如α-氨基丁酸)是抗性的。
以上制备的产生l-甲硫氨酸前体的菌株的培养可通过本领域技术人员已知的合适的培养基和条件进行。本领域技术人员充分理解，培养方法可根据选择的菌株通过容易地调节而使用。例如，所述培养方法包括，但不限于，分批、连续培养和补料分批。多种培养方法描述在例如j.m.lee的“biochemicalengineering”，prentice-hallinternationaleditions，138-176页中。
培养基必需符合对于特定菌株的培养条件。多种微生物培养基描述在例如americansocietyforbacteriology的“manualofmethodsforgeneralbacteriology”，washingtond.c.，usa，1981中。这些培养基包括各种碳源、氮源和痕量元素。所述碳源以如下为例：碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；脂肪例如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇例如甘油和乙醇；以及有机酸如乙酸。
这些化合物之一或其混合物可用作碳源。氮源以如下为例：例如蛋白胨、酵母提取物、肉汁(gravy)、麦芽提取物、玉米浆(csl)和豆粉的有机氮源，以及例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵的无机氮源。这些化合物之一或其混合物可用作氮源。
本文中的培养基可另外包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠盐作为磷酸根源。所述培养基还可包括金属盐例如硫酸镁或硫酸铁。另外，也可加入氨基酸、维生素和合适的前体。所述培养基和所述前体可通过分批或连续地加入到培养物中。
培养物的ph可在培养过程中通过以合适的方式加入例如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物而调节。为了维持培养物的需氧条件，可将氧气或含氧气的气体(如空气)注入到培养物中。培养物的温度常规地在20℃-45℃的范围内、优选在25℃-40℃的范围内。
培养周期可持续直到l-甲硫氨酸前体的产生达到所需水平，且优选的培养时间在10小时至160小时的范围内。
本发明的方法使得能够选择性制造l-甲硫氨酸(这优于将d-甲硫氨酸和l-甲硫氨酸一起制造的常规化学合成)且在没有另外独立的过程的情况下产生有机酸如琥珀酸或乙酸作为副产物。
具体实施方式
下列实施例说明本发明，而没有任何意图限制在所附权利要求中限定的本发明的范围。本发明的实践和目前优选的实施方式仅以说明性的目的显示在下列实施例中。
但是，将了解，本领域技术人员在考虑本公开内容时可在本发明的精神和范围内进行改变和改善。
实施例1-4
实施例1-4采用在反应介质上方的多种甲硫醇(ch3sh)分压进行。这些分压在下列实施例中范围为10kpa-200kpa。
所有测试在包括5l不锈钢夹套反应器的设备中实施，所述反应器配备有：以锚桨为末端且装有具有转速计的搅拌器马达的搅拌器、允许油在夹套内循环的恒温调节浴、在护套内的温度探针、ph探针、压力计、引入氮气的入口和经由汲取管引入甲硫醇的入口。甲硫醇的流速使用质量流量计测量和控制。
对于所有试验应用下列程序：
将稀释在3l蒸馏水中的225go-乙酰基高丝氨酸(oahs，1.4摩尔)引入到反应器中。
以设定到600rpm的搅拌速度在33℃(反应温度)下加热反应介质。
当反应温度达到33℃时，加入在蒸馏水中28重量％的氨将ph调节在6.5。
将3ml的在蒸馏水中10mm的吡哆醛-5'-磷酸(plp)溶液加入反应器中。plp用作辅酶。随后将反应器密封地关闭。
另外，使甲硫醇在装有汲取管的加压圆筒中液化。将高于ch3sh压力的氮气压力施加在液化的ch3sh上方。通过该方式，可将液体ch3sh在主反应器中引入反应介质中。ch3sh在主反应器中自发地气化。
在搅拌的同时，在几分钟到一或两小时后达到反应器中液体和气相之间的平衡状态。ch3sh分压显示在压力计上且使用阀控制在对于所述实施例的所需值。甲硫醇也以受控的流速引入。
甲硫醇分压设定到10kpa(实施例1)、100kpa(实施例2)、150kpa(实施例3)和200kpa(实施例4)。
将9g酶(例如wo2008/013432中描述的)溶解在150ml的蒸馏水中并使用中间氮气加压容器引入反应器中。
当已经引入化学计量(67.2g，1.4摩尔)时，停止引入甲硫醇(ch3sh)。从该点开始，ch3sh分压降低直到反应时间的结束。
反应时间自始至终，加入氨将ph维持在6.2-6.5，如前面所述。实际上，反应介质的ph随着时间降低，这是由于作为反应的副产物的乙酸的释放。
每一小时，将样品取出反应器且通过hplc(高压液相层析法)分析以确定残余oahs和l-甲硫氨酸含量。
下表1整理实施例1-4的结果：
表1
比较例如实施例1和实施例2中在3小时的oahs转化率即l-甲硫氨酸产率，这些结果首先显示ch3sh分压的有益效果提高。参见例如实施例4中在3小时的oahs转化率即l-甲硫氨酸产率，ch3sh分压的进一步增加导致有害的效果。
这些首先的4个试验清楚地表明，对于在反应器内明确的ch3sh分压(在上述实施例中为10kpa-150kpa，且优选100kpa-150kpa)，达到最佳的oahs转化率以及由此的最佳l-甲硫氨酸产率。
实施例5-7
在下列实施例5-7中描述的测试在使用如在前实施例中描述的相同程序的30l反应器中实施，但是在37℃而不是33℃的反应温度下进行，且使用另一新鲜酶溶液样品，其中首先将plp溶液化并在引入反应器中之前缓慢搅拌二十分钟。
该酶/plp溶液用1.2l的根据wo2008/013432新鲜制备的酶溶液和25ml的在蒸馏水中的10mm的plp溶液制备。使用的oahs的量为1480g，其稀释在18.5l蒸馏水中。
如在前实施例所述地，用氨将反应介质的ph调节到6.2，且将搅拌速度设定到300rpm。
下表2整理实施例5-7的结果。
表2
这些实施例显示关于甲硫醇分压的效果的相同现象。证实对于该反应，存在可获得最好性能的最佳压力。该最佳ch3sh分压这里再次观察到为10kpa到小于200kpa。