本发明涉及动物病原分子诊断技术领域，特别是指一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂、试剂盒及使用方法。
背景技术：
禽流感病毒是属于甲型流感病毒的一种，属于rna病毒的正黏病毒科。流感病毒颗粒外膜有两种类型表面糖蛋白，一型为血细胞凝集素(h)，分为15个亚型，一型为神经氨酸酶(n)，分为9个亚型。在禽流感病毒中，h3、h5、h7、h9可以传染给人。其中h5、h7为高致病性亚型，潜伏期很短，突然爆发，大多无临床症状而突然死亡，发病率和致死率极高，h9为在我国部分地区流行的中低致病性亚型。禽流感使禽类产品严重滞销，价格大幅下跌，养殖户损失惨重，给养禽业造成很大损失。
在诊断禽流感时，一般根据检测结果，结合该禽类养殖场的疫病流行病学、临床症状、病理剖解变化，对该病进行系统的诊断。现有的荧光pcr检测，存在灵敏度不够，同时检测多种亚型耗时较多的问题。因此，亟需建立一种能够同时灵敏、特异、高效检测h5、h7以及n9禽流感病毒的检测手段。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种能够快速而准确的用于非洲猪瘟病毒的早期检测的荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法。
基于上述目的本发明提供的一种禽流感h5、h7以及h9亚型的pcr检测试剂盒，包括h5\h7\h9反应液，rna酶混合液、h5\h7\h9-内标、h5\h7\h9-阳性对照以及h5\h7\h9-阴性对照；
其中，所述h5\h7\h9反应液包括：
h5引物组：引物h5f-1：5’-gcattggttatcatgcaaayaa-3’和引物h5r-1：5’-gatgtcctggg-3’以及探针h5p-1：5’-fam-agcaggttgacacaataatggaraaga-bhq1-3’，fam为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团；
h7引物组：引物h7f-1：5’-agggaactgctgcagattacaa-3’和引物h7r-1：5’-gaatctctggtccaatttatcacata-3’以及探针h7p-1：5’-rox-ccaaccaacaatttgagttgatagacaa-bhq2-3’，rox为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；
h9引物组：引物d-h9f-2：5’-atccaatgggaatctaathgct-3’和引物d-h9r-2：5’-ttaaatcagtcttcagrattcttcc-3’以及探针d-h9p-2：5’-cy5-catggtatggacacgtt-bhq2-3’，cy5为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；以及
内标引物组：内标引物ipc01f：5’-cacggctgagagaacatgga-3’和内标引物ipc01r：5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及探针ipc01p：5’-hex-cgactgcactgcacttggtcgatctg-bhq1-3’，hex为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团。
在其中一个实施例中，所述h5\h7\h9-反应液中，引物h5f-1、h5r-1、h7f-1、h7r-1、d-h9f-2以及d-h9p-2的终浓度范围是200～300nm，探针h5p-1、h7p-1以及d-h9p-2为100～200nm；内标引物ipc01f与ipc01r的是100～200nm，内标探针ipc01p的为100～200nm。
在其中一个实施例中，所述rna酶混合液包括酶稀释液、热启动taq酶与mmlv酶，所述热启动taq酶的终浓度为1～2u/μl。
在其中一个实施例中，所述h5\h7\h9-内标的核苷酸序列为：ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag，浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl。
在其中一个实施例中，所述h5\h7\h9-阳性对照浓度为重组质粒，所述重组质粒的核苷酸序列为cgtttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaggcaatgcaaaatagaatacagatcaacccggtcaaactaagcagcggttataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccattgcaatgggccttgtcttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatattattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatggatcttgcaga，浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl。
在其中一个实施例中，所述h5\h7\h9-阴性对照为用depch2o配制的te缓冲溶液。
在其中一个实施例中，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：
一种如上所述的禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒的制备方法，包括：合成编号为inf的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述h5\h7\h9-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过te缓冲溶液进行稀释，作为所述h5\h7\h9-阳性对照；
随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至puc57载体上，形成编号为puc-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入h5\h7\h9扩增体系中进行扩增，筛选对h5\h7\h9扩增体系的荧光曲线和ct值无干扰的一套，作为所述h5\h7\h9-反应液的内标引物与内标探针。
在其中一个实施例中：所述重组克隆质粒inf的核苷酸序列为cgtttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaggcaatgcaaaatagaatacagatcaacccggtcaaactaagcagcggttataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccattgcaatgggccttgtcttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatattattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatggatcttgcaga；
所述重组质粒puc-ipc的核苷酸序列为ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag；
所述内标引物与探针的编号及序列分别为：引物ipc01f-5’-cacggctgagagaacatgga-3’、引物ipc01r-5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及探针ipc01p-5’-hex-cgactgcactgcacttggtcgatctg-bhq1-3’。
一种如上所述的禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒的使用方法，包括：
提供待检测样本，所述待检测样本为鸡的泄殖腔拭子、气管、肺、脾或淋巴等组织；
采用商业试剂盒提取所得待检测样本的rna；
使用所述禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒，对所得待检测样本的rna进行pcr扩增：依次进行50℃逆转录30min；95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火延伸30s，收集荧光，进行40个循环；25℃延伸10s；
根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数ct值判定结果：待检测样品的ct值小于等于35且扩增曲线呈s型，为阳性；待检测样品的检测结果的ct值大于35且小于等于40且扩增曲线呈s型，则进行第二次检测，若第二次检测无ct值则为阴性，若第二次检测有ct值则为阳性；待检测样品的检测结果无报告ct值，内标检测结果的ct值小于等于35时，为阴性；若待检测样品的检测结果无报告ct值，内标检测结果的ct值大于35或无显示时，结果无效，需对此样品进行重复检测。
从上面所述可以看出，本发明提供的禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法中，h5引物组、h7引物组以及h9引物组的引物以及探针具有优良的敏感性与特异性，极大地减少了可能出现的因引物探针错配导致的漏检。配合内标引物ipc01f和ipc01r以及内标探针ipc01p可以监测整个pcr反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果。使用本发明的试剂盒进行检测，使用可使待检测样品的rna边逆转录边扩增，极大地减少逆转录完成后再扩增造成的扩增产物残留对pcr产生的污染，并有效避免假阳性的结果出现。操作简便，可快速准确的同时检测三种不同的禽流感亚型，利于产业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例的h5组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图2为本发明实施例的h7组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图3为本发明实施例的h9组的引物与探针的线性扩增曲线图；
图4为本发明实施例的内标ipc01引物组与h5引物组的双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中h5引物组的荧光扩增曲线，曲线2为体系中内标ipc01引物组的荧光扩增曲线；
图5为本发明实施例的内标ipc01引物组与h7引物组的双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中h7引物组的荧光扩增曲线，曲线2为体系中内标ipc01引物组的荧光扩增曲线；
图6为本发明实施例的内标ipc01引物组与h9引物组的双重扩增体系的荧光扩增曲线图，曲线1为体系中h9引物组的荧光扩增曲线，曲线2为体系中内标ipc01引物组的荧光扩增曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，本发明实施例中所有使用“第一”和“第二”的表述均是为了区分两个相同名称非相同的实体或者非相同的参量，可见“第一”“第二”仅为了表述的方便，不应理解为对本发明实施例的限定，后续实施例对此不再一一说明。
本发明实施例提供一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂，包括h5引物组、h7引物组、h9引物组以及内标引物组，
所述h5引物组包括引物h5f-1：5’-gcattggttatcatgcaaayaa-3’和引物h5r-1：5’-gatgtcctggg-3’以及探针h5p-1：5’-fam-agcaggttgacacaataatggaraaga-bhq1-3’，fam为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团；
所述h7引物组包括引物h7f-1：5’-agggaactgctgcagattacaa-3’和引物h7r-1：5’-gaatctctggtccaatttatcacata-3’以及探针h7p-1：5’-rox-ccaaccaacaatttgagttgatagacaa-bhq2-3’，rox为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；
所述h9引物组包括引物d-h9f-2：5’-atccaatgggaatctaathgct-3’和引物d-h9r-2：5’-ttaaatcagtcttcagrattcttcc-3’以及探针d-h9p-2：5’-cy5-catggtatggacacgtt-bhq2-3’，cy5为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；以及
所述内标引物组包括内标引物ipc01f：5’-cacggctgagagaacatgga-3’和内标引物ipc01r：5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及内标探针ipc01p：5’-hex-cgactgcactgcacttggtcgatctg-bhq1-3’，hex为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团。
本发明实施例还提供一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒，包括h5\h7\h9反应液，rna酶混合液、h5\h7\h9-内标、h5\h7\h9-阳性对照以及h5\h7\h9-阴性对照：
其中，所述h5\h7\h9反应液包括：
h5引物组：引物h5f-1：5’-gcattggttatcatgcaaayaa-3’和引物h5r-1：5’-gatgtcctggg-3’以及探针h5p-1：5’-fam-agcaggttgacacaataatggaraaga-bhq1-3’，fam为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团；
h7引物组：引物h7f-1：5’-agggaactgctgcagattacaa-3’和引物h7r-1：5’-gaatctctggtccaatttatcacata-3’以及探针h7p-1：5’-rox-ccaaccaacaatttgagttgatagacaa-bhq2-3’，rox为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；
h9引物组：引物d-h9f-2：5’-atccaatgggaatctaathgct-3’和引物d-h9r-2：5’-ttaaatcagtcttcagrattcttcc-3’以及探针d-h9p-2：5’-cy5-catggtatggacacgtt-bhq2-3’，cy5为报告荧光基团，bhq2为淬灭荧光基团；以及
内标引物组：内标引物ipc01f：5’-cacggctgagagaacatgga-3’和内标引物ipc01r：5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及探针ipc01p：5’-hex-cgactgcactgcacttggtcgatctg-bhq1-3’，hex为报告荧光基团，bhq1为淬灭荧光基团。
本发明实施例提供的禽流感试剂盒中的h5引物组和探针、h7引物组和探针以及h9引物组和探针具有优良的敏感性与特异性，可以同时快速检测三种禽流感病毒，极大缩短禽流感分型检测的检出时间，并极大减少因引物探针错配导致的漏检。配合内标引物ipc01f和ipc01r以及内标探针ipc01p可以监测整个pcr反应体系是否正常，从而避免因使用不当造成的错误的判定结果，使检测结果具有极佳地准确性。
作为优选的实施例，所述检测试剂盒中，各组分的含量为：h5\h7\h9反应液2150μl；rna酶混合液100μl；h5\h7\h9-内标100μl；h5\h7\h9-阳性对照50μl；h5\h7\h9-阴性对照500μl。
优选地，所述h5\h7\h9-反应液中，引物h5f-1、h5r-1、h7f-1、h7r-1、d-h9f-2以及d-h9p-2的终浓度范围是200～300nm，探针h5p-1、h7p-1以及d-h9p-2为100～200nm；内标引物ipc01f与ipc01r的是100～200nm，内标探针ipc01p的为100～200nm，以使检测效率更高。
应当理解的是，所述h5\h7\h9-反应液中，还包括pcr-buffer(缓冲液)以及dntp(脱氧核糖核苷)等常规试剂盒组分，所述dntp包括datp、dttp、dgtp以及dctp四种。
所述rna酶混合液包括酶稀释液、热启动taq酶与mmlv酶(来自鼠白血病逆转录酶)。热启动taq酶的终浓度优选为1～2u/μl，配合高效率的逆转录mmlv酶，起到共同抑制假阳性的作用。同时，两者协同作用，还可实现rna的一步扩增，使rna逆转录为dna并同时扩增，即边逆转录边扩增。可以有效减少先逆转录后扩增带来的产物残留以及气溶胶污染等，提高检测的准确率。
h5\h7\h9-内标编号puc-ipc，浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl，核苷酸长度455bp，核苷酸序列为：ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag。h5\h7\h9-内标的使用可用于监测整个pcr反应体系是否正常，可避免因临床样品的复杂性、保存不当、试剂配制错误以及误加样等因素导致检测结果的“假阴性”，即能够极大地避免因操作不当造成的错误的判定结果。
h5\h7\h9-阳性对照浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl的重组质粒，编号为inf。所述重组质粒的核苷酸序列与禽流感亚型的扩增产物的目标的序列相同，均为cgtttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaggcaatgcaaaatagaatacagatcaacccggtcaaactaagcagcggttataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccattgcaatgggccttgtcttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatattattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatggatcttgcaga。
h5\h7\h9-阴性对照为用depch2o配制的te缓冲溶液(tris-edtabuffersolution)。
本发明实施例还提供一种上述禽流感h5\h7\h9亚型荧光pcr检测试剂盒的制备方法，包括：
s110，合成编号为inf的重组克隆质粒，所述重组克隆质粒含有所述h5\h7\h9-反应液中引物的扩增产物的目标核苷酸序列，并用蛋白核酸测定仪对所述重组克隆质粒的浓度进行定量，将定量后的所述重组克隆质粒通过te缓冲溶液进行稀释，作为所述h5\h7\h9-阳性对照；
s120，随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至puc57载体上，形成编号为puc-ipc的重组质粒，并根据所述重组质粒的序列合成多套内标引物与探针，分别将所述多套内标引物与探针加入h5\h7\h9扩增体系中进行扩增，筛选对h5\h7\h9扩增体系的荧光曲线和ct值无干扰的一套，作为所述h5\h7\h9-反应液的内标引物与内标探针。
步骤s110中，根据所述h5\h7\h9-反应液的引物的目的基因的扩增产物合成所述重组克隆质粒inf，其序列为cgtttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaggcaatgcaaaatagaatacagatcaacccggtcaaactaagcagcggttataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccattgcaatgggccttgtcttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatattattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatggatcttgcaga。
根据实际浓度测定值，将所述定量后的重组克隆质粒inf通过te缓冲溶液稀释为1.0×104～5.0×104copies/μl，作为阳性对照。
步骤s120中，使用随机序列的重组质粒puc-ipc作为内标，不会对目的基因的扩增造成影响，因而具有较佳的监控假阴性的功能。具体地，所述重组质粒puc-ipc的核苷酸序列为：ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag。
根据上述puc-ipc的核苷酸序列，合成三套内标引物与探针。具体地，第一套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物ipc01f-5’-cacggctgagagaacatgga-3’、引物ipc01r-5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及探针ipc01p-5’-hex-cgactgcactgcacttggtcgatctg-bhq1-3’；第二套内标引物与探针的编号及序列分别为：引物ipc03f-5’-cgcttggataacgaccta-3’、引物ipc03r-5’-gggcataaaccccactcctaa-3’以及探针ipc03p-5’-hex-tcctctaagccactgtccacacc-bhq1-3’；第三套内标引物与探针的编号及序列分别为：内标引物ipc05f-5’-cacggctgagagaacatgga、内标引物ipc05r-5’-gaaaggtcccgcaaagagt以及内标探针ipc05p-5’-hex-ccggtgataaacctttggaccct-bhq1-3’。
筛选时，分别将所述三套内标引物与探针体系加入h5\h7\h9扩增体系中组合成三组双重扩增体系。对所述三组双重扩增体系以及未加内标体系的h5\h7\h9单重扩增体系，加入模板进行扩增，并比较所得荧光曲线以及ct值。筛选对h5\h7\h9体系无干扰的第一套作为所述h5\h7\h9-反应液的内标引物与内标探针。
本发明实施例还提供一种禽流感h5\h7\h9亚型的荧光定量pcr检测方法，包括：
s210，提供待测样品，所述待测样品选自死鸡的肺、脾、肝以及淋巴结中的任一组织；或选自活鸡的咽拭子或鼻拭子；
s220，采用商业试剂盒提取所述待测样品的rna；
s230，将试剂盒中除rna酶混合液外的各组分溶解混匀，再加入rna酶混合液制成pcr混合液；
s240，取三支试管，分别加入h5\h7\h9-阴性对照、h5\h7\h9-阳性对照以及待测样本，以及每支加入所述pcr混合液；
s250，分别将上述试管放入pcr仪扩增，依次进行50℃下逆转录2分钟,95℃预变性5分钟,95℃下变性15秒，60℃下退火延伸30秒，采集荧光信号，进行40个pcr循环，25℃延伸10秒；
s260，根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数ct值判定结果:当内标检测结果的ct值小于等于36时，结果有效；若内标检测结果的ct值大于36时，结果无效，需重复此样品的检测。
步骤s230中，所得pcr混合液，每只每份样品中具体可以包括，h5\h7\h9-反应液43μl、rna酶混合液2μl以及h5\h7\h9-内置参照0.5μl，以使检测结果更加准确。
优选地，步骤s260中，所述根据荧光信号到达设定域值所经历的循环数ct值判定结果的步骤中，所述判定结果包括定性判定结果：
待检测样品的检测结果的ct值小于或等于35且扩增曲线呈s型，为阳性；
待检测样品的检测结果的ct值大于35且小于等于40且扩增曲线呈s型，则进行第二次检测，若第二次检测无ct值则为阴性，若第二次检测有ct值则为阳性；
待检测样品的检测结果无报告ct值，内标检测结果的ct值小于等于35时，为阴性；
若待检测样品的检测结果无报告ct值，内标检测结果的ct值大于35或无显示时，结果无效，需对此样品进行重复检测。
实施例1试剂盒的制备方法
分析比对ncbi中禽流感h5\h7\h9基因序列信息，选取高度保守区域的序列分别设计针对h5\h7\h9的三组特异性引物与探针序列，各组的序列与标记信息请参阅表1。请参阅图1至图3，可以看出，以上三组引物与探针分别进行扩增试验后，扩增曲线形态均良好。
根据上述筛选得到的h5\h7\h9的引物的目的基因的扩增产物合成重组质粒inf，其序列与为h5\h7\h9的引物的目的基因的扩增产物相同，均为cgtttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaggcaatgcaaaatagaatacagatcaacccggtcaaactaagcagcggttataaagatgtgatactttggtttagcttcggggcatcatgtttcatacttcttgccattgcaatgggccttgtcttcatatgtgtgaagaatggaaacatgcggtgcactatttgtatattattcgactgtcgcctcatctcttgtgattgcaatggggtttgctgccttcttgttctgggccatgtccaatggatcttgcaga。用蛋白核酸测定仪对inf的浓度进行定量，并使用te溶液稀释，得到浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl的阳性对照。
随机生成长度为455bp的核苷酸序列，连接至puc57载体上，形成编号为puc-ipc的重组质粒，核苷酸序列为：ctggagactgagggttgacgcgcattcgtcattgaacgcagacacggctgagagaacatggagcgactgcactgcacttggtcgatctgattaggagtggggtttatgcccgcggcttatccccctatccttgcgacacgggagaagacagattgtcatcgatttcgcaagccatgatatgtttggcccgaccaaccgcgtttttctcgcgcttggataacgacctatggtgtggacagtggcttagaggacatgacacgacgggctgaaagtatgtggtgctggggcccttagatagctgcatagttggaccgctaggaattatatcaattcgagatctccagccgacaaagtaggctcctaactaacagggtccaaaggtttatcaccggtccttactctttgcgggacctttctacccatacaatatcgtcctccgatgatggatcacggag。
用蛋白核酸测定仪对puc-ipc的浓度进行定量，并使用te溶液稀释到浓度为1.0×104～5.0×104copies/μl，作为内标。
用depch2o配制的te溶液作为h5\h7\h9-阴性对照。
将1～2u/μl的热启动taq酶与逆转录mmlv酶，以及酶稀释液混合得到rna酶混合液。
表1禽流感h5/h7/h9引物与探针序列信息
表2内标引物与探针序列信息表
请参阅表2，根据puc-ipc的核苷酸序列设计3套内标引物与探针，其中探针5’端统一标记hex荧光基团，探针3’端统一标记bhq1荧光基团，并分别加入h5\h7\h9扩增体系中合成双重扩增体系。根据双重扩增体系和未加内标体系的h5\h7\h9单重扩增体系的荧光扩增曲线，筛选第一套内标引物与探针为最佳内标引物与探针。如图4至图6所示，第一套内标引物与探针扩增体系，对h5\h7\h9扩增体系的荧光曲线几乎均无干扰。
将所得h5引物组、h7引物组以及h9引物组按照引物终浓度为200～300nm，探针终浓度为100～200nm，以及内标引物ipc01f和ipc01r按照终浓度为100～200nm，内标探针ipc01p按照终浓度为100～200nm；以及pcr-buffer(缓冲液)和datp、dttp、dgtp以及dctp四种脱氧核糖核苷等常规试剂盒组分混合，得到h5\h7\h9反应液。
最终所得试剂盒中成分及含量如下所示：
实施例2试剂盒的使用方法
样品采集：活体采集咽拭子、鼻拭子；或剖杀病鸡，采集肺、脾、肝或淋巴结等组织作为样品。
rna提取：采用市售的商业试剂盒提取上述样品的rna。
扩增试剂配制：取出实施例1所得试剂盒中除rna酶混合液外的各组分，室温放置，待其彻底溶解后，震荡混匀备用；按比例(h5\h7\h9-反应液43μl/头份+rna酶混合液2μl/头份+h5\h7\h9-内标0.5μl/头份)取相应量的试剂，充分混匀成pcr-mix，瞬时离心。
加样：取三个反应管，分别取取5μl阴性对照/阳性对照/待测样本的pcr加入对应pcr反应试管，再向每个反应管中分别加入40μlpcr-mix，盖上管盖，短暂离心，转移至扩增区。
扩增：将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称；选择fam通道检测禽流感病毒h5亚型；选择rox通道检测禽流感病毒h7亚型；选择cy5通道检测禽流感病毒h9亚型；选择hex通道检测内标；设置反应体系为50μl；循环参数设定如表3所示。
表3扩增参数设置
结果分析与判定：待反应程序完成后，记录样品ct值与扩增曲线。
fam通道ct值≤35且扩增曲线呈s型，报告为h5检测阳性；rox通道ct值≤35且扩增曲线呈s型，报告为h7检测阳性；cy5通道ct值≤35且扩增曲线呈s型，报告为h9检测阳性；
fam、rox、cy5通道35＜ct值≤40且扩增曲线为s型，判定可疑，对该样品进行重复检测，如无ct值，则报告阴性，否则报告h5\h7\h9阳性；
fam、rox、cy5通道无ct值显示，同时hex(或vic)通道ct值≤35，报告为h5\h7\h9阴性；若hex(或vic)通道ct值>35或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。
本发明实施例提供的禽流感h5\h7\h9亚型的荧光pcr检测试剂盒、制备方法及检测方法，以多重实时荧光pcr检测技术为基础，通过采用特异性的分别针对h5\h7\h9亚型的引物与探针序列、添加puc-ipc内标体系与包含mmlv逆转录酶与热启动taq酶的rna酶混合液防污染体系，共同作用，可使待检测样品的rna边逆转录边扩增，极大地减少逆转录完成后再扩增造成的扩增产物残留对pcr产生的污染，并有效避免假阳性的结果出现。使用本发明提供的试剂盒进行检测的方法，操作简便，实现对三种不同的禽流感病毒亚型的快速可靠的检出与诊断，利于产业化生产。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
尽管已经结合了本发明的具体实施例对本发明进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>湖南国测生物科技有限公司
<120>一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂试剂盒、制备方法及使用方法
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