本发明涉及一种新的细胞内信使rna和环状rna标记方法，及其在细胞生物学中的应用。属于细胞生物学领域。
背景技术：
核糖核酸(rna)分子是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息的传递体。一个核糖核苷酸单体分子由一分子磷酸，核糖和碱基构成。核糖核苷酸单体的碱基主要有4种，即腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)。rna是由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成的长链状高分子聚合物。中心法则指出，dna通过转录形成rna，rna翻译成蛋白质发挥功能。rna是以dna的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息从dna到蛋白质的转移，是遗传信息传递过程中的桥梁。rna种类繁多，包括但不局限于信使rna(mrna)，核糖体rna(rrna)和转运rna(trna)。近年来发现的很多种类的其他rna在细胞的生命活动中也扮演着非常重要的角色，包括长非编码rna，erna，环状rna等。
近几十年来，显微镜和rna标记技术的进步使得rna分子的成像成为可能。在固定细胞和活细胞中对rna分子的直接标记能帮助我们获得rna分子的数量、位置、动态等信息，提供rna代谢过程的动力学，包括rna的转录、转运、修饰、翻译、降解等。最常用的rna标记方法是在固定细胞中的针对rna序列的荧光原位杂交，这是定位rna分子的金标准方法。在一条rna上设计多达几十个互补配对的探针可以增大信号，提高信噪比，能将rna的定位提高到单分子水平。同时荧光原位杂交还允许多色高通量同时标记定位多种类rna。但是荧光原位杂交的最大缺点是不能兼容活细胞，需要将细胞固定打孔才能把荧光标记的探针送入细胞中，所以只能得到rna的位置信息，而缺乏动态信息。而活细胞内的rna成像技术可以提供rna动态表达过程的实时数据。活细胞的标记方法主要包括分子信标，rna适配子系统，可编辑的rna识别蛋白。分子信标一般是短的dna分子，两端各连接一个荧光染料基团和淬灭基团。不结合到rna上时，dna分子内部可以形成配对的结构而使荧光染料淬灭不发光。结合到rna上时打开内部结构，使rna发光。然而，这些探针不能自主进入活细胞，需要使用显微注射等侵入性方法使探针进入细胞，这将会对细胞正常的生理活动产生一定的伤害。rna适配子系统是在待标记的rna的非编码区插入一段rna适配子，共表达rna适配子结合蛋白或者加入透膜结合染料可以实现rna的非侵入性标记。当在rna的非编码区插入多重适配子后，就可以实现rna的单分子标记。这种方法是目前活细胞中rna标记最常用的方法。但是插入多个适配子后会影响rna的本身的代谢过程，阻碍rna的运输。基于可编辑的rna结合蛋白标记rna分子的原理是通过调整蛋白质或者sgrna的序列，可以对内源性不加任何标签的rna进行标记。但该方法无法实现单分子标记，同时由于可编辑的rna结合蛋白一般比较大，可能会影响rna的运输过程。
此外，细胞中还存在一些很难标记的rna种类。其中重要的一种为环状rna。环状rna是一类不具有5'末端帽子和3'末端多聚腺苷酸尾巴、并以共价键形成环形结构的非编码rna分子。环状rna由可变剪切产生，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多。环状rna大量存在于真核细胞的细胞质中，但少部分内含子来源的环状rna则存在于细胞核内，具有一定的组织、时序和疾病特异性。与传统的线性rna不同，环状rna分子呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶rnaser降解，比线性rna更稳定，具有高度保守性。大多数环状rna来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成。部分环状rna分子含mirna应答元件，可充当竞争性内源rna，与mirna结合，在细胞中起到mirna海绵的作用，进而解除mirna对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达水平。部分环状rna也可以翻译成蛋白质，但大部分是非编码rna。由于每一种环状rna及其对应的线状异构体都是由同一个前体rna剪接而来，因此环形rna和线状rna以及前体rna共享部分核苷酸序列，很难针对序列的特异性标记来区别三者。
综上所述，目前需要开发可以实现活细胞内无侵入性的、对rna本身影响较小的、可以实现单分子分辨率的新型rna标记方法。本发明使用基于自连接标签的双分子荧光互补的技术，结合rna适配子系统，发展了新的活细胞内信使rna和环状rna的标记技术。在信使rna的5'非翻译区末端插入串联的rna适配子ms2和pp7，二者相距20个碱基。在合适的位点将自连接标签halotag分裂为两个部分，halotagn和halotagc，分别融合rna适配子的结合蛋白tdpcp和tdmcp。在分裂的halotag蛋白融合无相互作用蛋白时不发荧光，当两个蛋白有直接相互作用或依靠其他支架相互靠近时，可以使分裂的两段自连接标签在空间上相互靠近，形成完整的有功能的自连接标签，可以结合染料，发出荧光。当halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc不结合信使rna上的适配子时，信使rna分子不发荧光，从而降低细胞内的背景。当且仅当halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc结合信使rna上的适配子时，信使rna分子发出荧光。这样可以降低细胞内rna标记的荧光背景。同时，因为染料分子亮度高，信使rna分子上仅结合一个染料分子就可以对信使rna分子进行单分子标记。
而环状rna的标记方法与信使rna的标记类似但略有不同。在环状rna所对应的前体信使rna的剪接受体和剪接供体之间分别插入rna适配子ms2和pp7，使二者在反向成环后相距20个核苷酸。在剪接受体和剪接供体的上下游内含子中插入反向重复序列可以使rna形成配对的高级结构，剪接受体和剪接供体相互靠近，更容易发生反向剪接。当发生正向剪接时，ms2和pp7相互远离，无法在空间上相互靠近，结合其上的halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc不能互补形成一个完整的分子，不发荧光。当发生反向剪接时，ms2和pp7在空间上相互靠近，结合其上的halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc可以互补形成一个完整的分子，发荧光。利用这种方法就可以特异性地只标记出某个前体rna对应的环状rna而不标记其所对应的线性rna。同时，因为染料分子亮度高，环状rna分子上仅结合一个染料分子就可以对环状rna分子进行单分子标记。
而且所使用的标记方法为有机染料，不同于荧光蛋白，有机染料在一次激发过程中能释放出更多的光子，亮度更高。同时有机染料更稳定，能一定程度上抵抗光漂白，可以观测更长时间。
综上所述，本发明所提供的基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内rna标记方法可以用于活细胞和固定细胞的信使rna和环状rna的长时程无干扰单分子成像观测和追踪。在细胞生物学中具有非常广阔的应用前景(说明书附图1)。
技术实现要素：
本发明的技术目的是发展基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内rna标记方法，可以实现活细胞内长时间无背景的标记和追踪细胞内信使rna和环状rna的目的，用以解决活细胞内无侵入性、影响小、单分子水平标记和追踪rna的问题。
本发明公开一种基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内信使rna标记方法，利用分裂的自连接标签蛋白融合适配子结合蛋白，实现在非编码区插入适配子的信使rna的标记成像。在融合蛋白不结合信使rna分子时不发荧光，在其结合信使rna分子时发出荧光，从而实现活细胞内无荧光背景的rna分子的稳定标记和长时程成像追踪，以提供信使rna生命周期中的动态信息。
本发明公开一种基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内环状rna标记方法。在环状rna所对应的前体信使rna的剪接受体和剪接供体之间分别插入rna适配子ms2和pp7，使二者在反向剪接成环后相距20个核苷酸。利用分裂的自连接标签蛋白融合适配子结合蛋白实现环状rna的标记成像。在融合蛋白不结合环状rna分子时不发荧光，在其结合环状rna分子时发出荧光，在其结合到线性的rna上时不发荧光，从而实现活细胞内无荧光背景的环形rna分子的稳定标记和长时程成像追踪，帮助理解环状rna的形成和转运机制。
本发明公开的基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内信使rna和环形rna标记方法，所使用的体系可以是活细胞，也可以是固定细胞。当在活细胞中使用时可以观测细胞内信使rna和环形rna的亚细胞定位，追踪分子动态运输过程，统计绝对分子数量等。当在固定细胞中使用时，可以用来观测信使rna和环形rna亚细胞定位，统计绝对分子数量等。
本发明公开一种基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内信使rna和环形rna标记方法，在具体实施过程中，可以根据所标记的rna分子种类灵活调整所插入的适配子位置和构象。在信使rna的标记应用中，适配子可以插入5'端非编码区，也可以插入3'端非编码区。为了不影响信使rna的翻译过程，一般将适配子插入信使rna的3'端非编码区。在环形rna的标记应用中，适配子的插入位置比较局限，一般放在成环的剪接供体和剪接受体之间，且两个适配子要分开插入。
本发明所公开的一种基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内信使rna和环形rna标记方法，包括以下步骤：
(1)首先在待标记的信使rna或环形rna的合适位置插入相应的适配子序列。
(2)确定自连接标签蛋白的分裂位点，通过pcr扩增出分裂的两段蛋白，将之分别融合到适配子结合蛋白上，连入具有表达框的载体，构建成质粒。
(3)将所构建的质粒共转染哺乳动物细胞。
(4)加入染料，在显微镜下观察细胞信使rna或环形rna的结构和动态。
附图说明
图1自连接标签双分子荧光互补的信使rna和环状rna标记方法示意图。上图：信使rna的标记方法。在信使rna的3'末端插入串联的rna适配子ms2和pp7，二者相距20个碱基。在合适的位点将自连接标签halotag分裂为两个部分，halotagn和halotagc，分别融合rna适配子的结合蛋白tdpcp和tdmcp。在分裂的halotag蛋白融合无相互作用蛋白时不发荧光，当两个蛋白有直接相互作用或者依靠其他支架相互靠近时，可以使分裂的两段自连接标签在空间上相互靠近，形成完整的有功能的自连接标签，可以结合染料，发出荧光。当halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc不结合信使rna上的适配子时，信使rna分子不发荧光。当且仅当halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc结合信使rna上的适配子时，信使rna分子发出荧光。这样可以降低rna标记的荧光背景。同时，因为染料分子亮度高，信使rna分子上仅结合一个染料分子就可以对信使rna分子进行单分子标记。下图：环状rna的标记方法。在环状rna所对应的前体信使rna的剪接受体和剪接供体之间分别插入rna适配子ms2和pp7，使二者在反向成环后相距20个核苷酸。在剪接受体和剪接供体的上下游内含子中插入反向重复序列可以使rna形成配对的高级结构，剪接受体和剪接供体相互靠近，更容易发生反向剪接。当发生正向剪接时，ms2和pp7相互远离，无法在空间上相互靠近，结合其上的halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc不能互补形成一个完整的分子，不发荧光。当发生反向剪接时，ms2和pp7在空间上相互靠近，结合其上的halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc可以互补形成一个完整的分子，发荧光。利用这种方法就可以特异性地只标记出某个前体rna对应的环状rna而不标记其所对应的线性rna。同时，因为染料分子亮度高，环状rna分子上仅结合一个染料分子就可以对环状rna分子进行单分子标记。
图2基于自连接标签的双分子荧光互补标记单分子信使rna和其他方法标记信使rna对比。(a)rna插入标签大小对比。利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记单分子信使rna只需要在靶rna的蛋白质编码基因的3'端插入一个ms2和pp7即可，大小仅为120个核苷酸。利用多重串联相同的rna适配子或者多重串联不相同的适配子系统一般需要24个适配子，长度达到1500个核苷酸。对于长度仅为数千个碱基的信使rna来说，新的标记方法对rna本身的影响较小。(b)rna结合蛋白大小对比。利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记的单分子信使rna分子其上只结合一个halotagn-tdpcp和tdmcp-halotagc，标签的总分子量为96.1千道尔顿。而利用多重串联相同的rna适配子或者多重串联不相同的配子系统标记的单分子rna其上需要结合1153.2千道尔顿的标记蛋白。综上所述，从插入标签大小和结合蛋白大小两个角度来说，基于自连接标签的双分子荧光互补标记单分子信使rna的方法要比利用多重串联相同的rna适配子或者多重串联不相同的适配子系统对信使rna本身影响更小。
图3基于自连接标签的双分子荧光互补标记单分子信使rna。(a)单分子rna的荧光图像。在cfp基因的3'端插入距离为20个碱基的适配子ms2和pp7，利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记单分子信使rna的方法对其进行标记。在人乳腺癌细胞mda-mb-231中共转染相应的质粒。加入染料后标记cfp对应的信使rna分子。cfp基因表达青蓝色荧光蛋白，用于区分转染的细胞和未转染的细胞。在表达cfp蛋白质的细胞中，在561nm通道可以检测到相应的信使rna单分子信号。(b)利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记cfp的单分子信使rna在一个细胞内的分子运动轨迹。(c)利用多重串联相同的rna适配子标记cfp的单分子信使rna在一个细胞内的分子运动轨迹。(d)利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记cfp的单分子信使rna和利用多重串联相同的rna适配子标记cfp的单分子信使rna的平均平方位移。(e)利用基于自连接标签的双分子荧光互补标记cfp的单分子信使rna和利用多重串联相同的rna适配子标记cfp的单分子信使rna的扩散系数频率分布直方图。
图4利用自连接标签的双分子荧光互补标记单分子环状rna。(a)环状rna的标记方法。在环状rna所对应的前体信使rna的剪接受体和剪接供体之间(zkscan1548-1047)分别插入rna适配子ms2和pp7，使二者在反向成环后相距20个核苷酸。在剪接受体和剪接供体的上下游内含子中插入反向重复序列。反向重复序列、剪接供体、剪接受体、ms2和pp7的序列都在图中标出。(b)环状rna标记的细胞明场通道。(c)环状rna标记的细胞荧光通道。图中白色虚线标记出细胞的轮廓，白色箭头指示环状rna的单分子信号。
具体实施方式
本发明的技术目的是发展基于自连接标签的双分子荧光互补的新型细胞内信使rna和环形rna标记方法，其特征在于，可以实现活细胞内无荧光背景的信使rna和环形rna分子的稳定标记和长时程成像追踪，以提供信使rna和环形rna生命周期中的动态信息。下面结合具体实施例进行说明。为了更清楚的阐述本发明的方法内容，现将本发明所涉及的产品和方法更进一步的总结如下，所涉及的实验数据、步骤或者合成方法等，属于本领域的常规技术，其并不对本专利的保护范围造成限制。这些具体的实施例只用于说明本发明，并不用于限制本发明的范围。
实施例一：基于自连接标签的双分子荧光互补标记细胞内信使rna。以所用的分裂的halotag标记cfp的信使rna为例进行说明：
(1)直接合成ms2和pp7的序列正反链，等比例混合，退火，连入cfp的基因的非编码区3'端，得到载体pcdna3.1(+)-cfp-ms2-pp7。
(2)通过pcr从含有tdmcp和tdpcp的质粒上扩增出相应的dna片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过dna琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的dna片段，得到tdmcp和tdpcp片段。所使用的pcr扩增体系如下：
(3)将上步回收的tdmcp和tdpcp与真核生物表达载体pcdna3.1(+)分别使用限制酶双酶切过夜，通过dna琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的dna片段。所使用的酶切体系如下：
(4)将经过酶切回收的tdmcp和tdpcp分别连入已经使用相同的酶切的载体pcdna3.1(+)，得到载体pcdna3.1(+)-tdpcp和pcdna3.1(+)-tdmcp。所使用的连接体系如下：
(5)通过pcr从含有完整的halotag的质粒上扩增出相应的halotag分裂片段。在扩增的引物上加入限制性酶切位点。通过dna琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的dna片段，得到halotagn58和halotagc58。所使用的pcr扩增体系参照步骤(2)。
(6)将上步回收的halotagn58和表达载体pcdna3.1(+)-tdpcp使用限制酶双酶切连接。将halotagc58和表达载体pcdna3.1(+)-tdmcp使用限制酶双酶切连接。所使用的酶切体系和连接体系分别参照步骤(3)和(4)。分别得到载体pcdna3.1(+)-halotagn58-tdpcp和pcdna3.1(+)-tdmcp-halotagc58。
(7)将人乳腺癌细胞系mda-mb-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在成像专用的35mmpetri-dish里，培养24小时。
(8)上述细胞使用6ml的脂质体lipo-2000共转染各1μg载体pcdna3.1(+)-cfp-ms2-pp7，pcdna3.1(+)-halotagn58-tdpcp，和pcdna3.1(+)-tdmcp-halotagc58。转染所用的培养基为不含血清的opti-mem。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(9)在上述转染的细胞培养基中加入halotag的结合底物染料jf549，终浓度为10nm。在培养箱中继续培养20分钟，以便使细胞与染料混合均匀。
(10)使用1×pbs清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。
(11)使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，采集信使rna的单分子实验数据。实验结果见说明书附图2和3。
实施例二：基于自连接标签的双分子荧光互补标记细胞内环状rna。以所用的分裂的halotag标记zkscan1(548-1047)的环状rna为例进行说明：
(1)直接合成ms2和pp7的序列正反链，等比例混合，退火，连入zkscan1(548-1047)剪接供体和受体之间，得到载体pcdna3.1(+)-circrnaminivector-ms2-zkscan1(548-1047)-pp7。
(2)将人乳腺癌细胞系mda-mb-231使用胰酶消化，按照50-60％的密度重新种植在成像专用的35mmpetri-dish里，培养24小时。
(3)上述细胞使用6ml的脂质体lipo-2000共转染各1μg载体pcdna3.1(+)-circrnaminivector-ms2-zkscan1(548-1047)-pp7，pcdna3.1(+)-halotagn58-tdpcp，和pcdna3.1(+)-tdmcp-halotagc58。转染所用的培养基为不含血清的opti-mem。转染完5小时，吸去转染液，换上新鲜的培养基。继续培养24小时。
(9)在上述转染的细胞培养基中加入halotag的结合底物染料jf549，终浓度为10nm。在培养箱中继续培养20分钟，以便使细胞与染料混合均匀。
(10)使用1×pbs清洗细胞三遍，以去除没有反应的游离染料。最后清洗完成后换上不含酚红的培养基。
(11)使用带有活细胞培养装置的高倍全内反射显微镜观察细胞内的荧光亮度。选择表达量较为合适的细胞，采集环状rna的单分子实验数据。实验结果见说明书附图4。
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