本发明属于分子生物学领域，涉及一种敲除人hmgb1基因的细胞株及其应用。
背景技术：
：crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)是细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出的特有的免疫系统---crispr系统，利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染色体上切除。近年来，科学家们从细菌中解析了这个系统的关键蛋白(cas9)，并掌握了这个关键蛋白的操作技术。以该关键蛋白为核心的复合物能在一段rna的指导下，定向寻找目标dna序列，然后编辑dna以扰乱基因或插入想要的序列。crispr方法正快速超越锌指核酸酶和其他编辑工具，能够快速的对生物dna序列进行修剪、切断、替换或添加，且操作简单，成本低廉。高迁移率蛋白(high-mobilitygroupproteins，hmgproteins)，广泛存在于真核生物细胞中，因其在聚丙烯凝胶电泳中的高迁移率而得名。hmg蛋白是真核细胞基因调控的动力体现者，是真核细胞内继组蛋白之后含量最为丰富的一组染色质蛋白质，它们在染色质的结构与功能及基因表达调控过程中均发挥着重要作用。hmg蛋白家族可分为hmga、hmgb和hmgn三类亚家族。高迁移率族蛋白1(highmobilegroupbox1，hmgb1)隶属于hmgb蛋白亚家族，是一种dna结合蛋白，存在于细胞核与细胞质中。细胞核中，hmgb1参与dna的复制、修复、重组、转录以及维持基因组稳定性等多种功能。胞外的hmgb1在炎症、免疫、细胞生长、增殖、死亡中均发挥重要的作用。除了核内和胞外功能，细胞质中的hmgb1还可以和多种蛋白结合，参与自噬、癌演进过程，可能还参与非传统分泌通路。在受到外部细菌感染(内毒素或内在致炎因子等)时，巨噬细胞和和单核细胞可以主动释放hmgb1；而坏死或损伤的细胞会因为细胞裂解等被动释放hmgb1。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种靶向敲除人hmgb1基因的grna序列。本发明的另一目的在于提供一种靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统。本发明的另一目的在于提供上述靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统的应用。本发明的另一目的在于提供一种敲除人hmgb1基因的细胞株。本发明的再一目的在于提供上述敲除人hmgb1基因的细胞株的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种靶向敲除人hmgb1基因的grna序列，其核苷酸序列为：5′-gagtatcgcccaaaaatcaa-3′，seqidno：1；其位于seqidno：4所示的第322～341位。一种靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统，含有上述靶向敲除人hmgb1基因的grna序列。所述的靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统的构建方法，包括如下步骤：(1)根据上述靶向敲除人hmgb1基因的grna序列，设计ghmgb1-f和ghmgb1-r，将ghmgb1-f和ghmgb1-r进行退火磷酸化后形成含有粘性末端的片段ghmgb1；(2)使用bsmbi酶切crispr/cas9慢病毒载体lenticrisprv2，得到酶切后的lenticrisprv2载体；(3)将步骤(1)的ghmgb1与酶切后的lenticrisprv2载体连接，得到靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统，命名为lenticrisprv2-hmgb1。ghmgb1-f：5′-caccggagtatcgcccaaaaatcaa-3′，ghmgb1-r：5′-aaacttgatttttgggcgatactcc-3′；所述的靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统在制备敲除人hmgb1基因的细胞株中的应用。优选的，在制备敲除人hmgb1基因的人huh7细胞株中的应用。一种敲除人hmgb1基因的细胞株，是将上述所述的靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统转染目的细胞株得到的。该细胞株是hmgb1基因沉默的细胞株，即该细胞株完全不表达hmgb1蛋白。一种敲除人hmgb1基因的细胞株，通过如下步骤构建得到：(1)将上述靶向敲除人hmgb1基因的crispr/cas9慢病毒系统通过包装细胞进行包装，得到慢病毒颗粒；(2)将慢病毒颗粒感染目的细胞株，得到敲除人hmgb1基因的细胞株。优选的，所述的目的细胞株为人huh7细胞株。具体包括以下步骤：1)在293t细胞上包装慢病毒颗粒转染293t细胞，慢病毒包装质粒lenticrisprv2-hmgb1：pspax2：pmd2.g＝2：2：1，收取293t包装慢病毒上清，离心后得含有慢病毒粒颗粒的悬液；2)huh7细胞感染慢病毒感染huh7细胞，dmem完全培养基体积：含有慢病毒粒颗粒的悬液体积比＝1～3：1；优选为2：1；3)嘌呤霉素筛选敲除细胞株将所收慢病毒接种huh7细胞培养24h后，加入有效浓度的嘌呤霉素，继续培养至细胞长满后传代；利用嘌呤霉素继续筛选传代细胞，2天更换一次培养液，筛选3～5代；鉴定后得到敲除人hmgb1基因的人huh7细胞株。步骤3)中，根据huh7细胞的敏感性加入的嘌呤霉素的浓度为1～2μg/ml；优选为1.5μg/ml。所述的敲除人hmgb1基因的细胞株在病毒增殖中的应用。所述的病毒为乙型脑炎病毒。所述的敲除人hmgb1基因的细胞株在乙脑研究上的应用。乙脑病毒sa14毒株在该细胞株上能大量增殖，该细胞株感染乙脑病毒sa14毒株后，与正常细胞株相比，其tcid50显著升高。所述的乙脑即流行性乙型脑炎(japaneseencephalitis，简称乙脑)。本发明的机理是：huh7是人类肝癌的传代细胞株，利用crispr/cas9系统，在huh7细胞中敲除hmgb1基因使其丧失该蛋白的表达，用于研究hmgb1蛋白在自噬、凋亡、细胞炎症、病毒感染等方面的具体作用机制。此前未见报道过关于hmgb1敲除的huh7细胞株，而且本发明筛选出的细胞敲除细胞株能够稳定传代，该敲除细胞株在细胞形态、生长速度等方面均与对照细胞无明显的差异，可作为理想的细胞模型。本发明公开的hmgb1基因敲除的人huh7细胞株已证实能够显著增强乙型脑炎病毒sa14毒株的感染。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1)利用crispr-cas9技术首次在人huh7细胞基因组上敲除hmgb1基因，使得hmgb1基因完全丧失该蛋白的表达，获得hmgb1敲除的huh7细胞株，操作简便，周期短，成本低，改造后细胞株稳定，可用于研究hmgb1蛋白在自噬、凋亡、细胞炎症、病毒感染等方面的具体作用机制；2)从基因、蛋白水平两方面检测都发现hmgb1蛋白已被敲除，说明hmgb1蛋白序列已被彻底改变，造成了hmgb1功能的彻底丧失，且敲除细胞株形态、生长速度等方面均与对照细胞无明显差异，是较为理想的hmgb1敲除的细胞模型；3)乙脑病毒能在该细胞株上能大量增殖，该细胞株感染乙脑病毒毒株后，与正常细胞株相比，其tcid50显著升高；能够显著增强乙型脑炎病毒毒株的感染。附图说明图1是目的片段ghmgb1插入lenticrisprv2载体图谱。图2是构建的lenticrisprv2-hmgb1质粒测序结果图。图3是敲除细胞株测序出现插入和缺失导致移码突变图。图4是hmgb1蛋白在敲除细胞株和对照细胞株中表达的wb检测图。图5是敲除细胞株和对照细胞株形态上无明显差异图。图6是乙型脑炎sa14毒株感染敲除细胞株测得tcid50显著高于对照细胞株。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning:alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1构建hmgb1基因敲除的慢病毒颗粒1)构建lenticrisprv2-hmgb1质粒根据thegenome-scalecrisprknock-out(gecko)libraries选择靶标hmgb1基因的grna序列：5′-gagtatcgcccaaaaatcaa-3′。按照lentiviralcrisprtoolbox，将hmgb1基因的grna克隆到lenticrisprv2(购自addgene，货号#98290)上(图1)，所构建质粒命名为lenticrisprv2-hmgb1。hmgb1基因的编码序列如seqidno：4所示，其中，hmgb1cds：ccds9335.1。根据lenticrisprv2载体连接末端的序列特点，设计合成上下游引物序列：ghmgb1-f：5′-caccggagtatcgcccaaaaatcaa-3′，ghmgb1-r：5′-aaacttgatttttgggcgatactcc-3′；将其按照固定的程序进行退火磷酸化后形成含有粘性末端的片段ghmgb1(25bp)。退火体系(50μl)：组分用量h2o30μlannealingbufferfordnaoligos(5×)10μlghmgb1-f5μlghmgb1-r5μl退火程序：95℃、5min，每一分钟下降一度至25℃。将含有粘性末端的片段ghmgb1连接到经过bsmbi酶切后的lenticrisprv2载体上，连接产物转化stbl3感受态细胞(stbl3感受态细胞的使用根据商品说明书进行，stbl3购自北京全式金生物技术有限公司，货号cd512-01)经37℃培养过夜，菌液pcr电泳检测得到多个阳性克隆菌，测序结果显示目标序列成功连入载体(图2)。正确的阳性克隆菌液按1：500比例接种于具有amp+抗性的lb液体培养基中，置37℃摇床中，180r/min振荡培养14～16h后，按照e.z.n.a.endo-freeplasmidmidikitⅱ说明书进行去内毒素质粒抽提即得到lenticrisprv2-hmgb1质粒。酶切体系(50μl)：组分用量lenticrisprv22μgbsmbi2μlbuffer(10×)5μlh2oto50μl酶切反应条件：55℃酶切2h。连接体系(20μl)：组分用量酶切后的载体2μlt4连接酶2μlt4buffer2μlghmgb114μl连接反应条件：16℃过夜连接。2)慢病毒颗粒包装将293t细胞(购自上海中科院细胞库)铺至60mm的细胞培养皿中，细胞生长至70～80％进行转染。转染前细胞换入1ml预热的无血清培养基(dmem)。首先，将6μglenticrisprv2-hmgb1表达载体质粒与6μgpspax2(购自addgene，货号#12260)和3μgpmd2.g(购自addgene，货号#12259)辅助质粒加入1mldmem中，混匀。然后，用hbs(配制的hbs平衡盐溶液，balancedsaltsolution)将100μm的pei(聚乙烯亚胺)储存液稀释成10μm，充分混匀。然后取稀释好的100μl10μmpei溶液加至上述含有质粒的dmem中，充分混匀后室温静置5～10min。最后，将这混合液逐滴加入待转染的293t细胞上，轻轻摇动培养皿混匀，置于含5％co2的37℃培养箱中孵育。3h后更换为4ml37℃预热的dmem。培养48h后收取含有慢病毒的细胞培养液，7000r/min4℃离心15min，得到的上清即为含有慢病毒颗粒的悬液。实施例2huh7感染慢病毒颗粒并筛选获得细胞株1)嘌呤霉素(puromycin)最优有效浓度的确定huh7细胞(购自上海中科院细胞库)按2×105个/ml的浓度接种于12孔板中，培养24h后，嘌呤霉素以浓度分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1μg/ml的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧培养基。每日观察细胞活力，根据细胞活力，每隔两天更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。选择能在3～5天内杀死所有细胞的浓度即为最优有效浓度。本次实验在huh7细胞上测得的最优有效浓度为1.5μg/ml。2)慢病毒颗粒感染huh7筛选细胞株将实施例1所收慢病毒颗粒接种huh7细胞，培养24h后，加入最优有效浓度的嘌呤霉素1.5μg/ml，继续培养至细胞长满后传代。利用嘌呤霉素继续筛选传代细胞，2天更换一次培养液，筛选3～5代。实施例3hmgb1基因敲除的细胞株鉴定1)基因组dna测序鉴定：按照e.z.n.atissuednakit试剂盒说明书，抽提细胞株基因组dna。在grna所靶标的基因序列区域上下游各200～300bp处设计引物，pcr扩增该片段，将其克隆至pmdtm19-tvector(takara)，挑选阳性质粒送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序。序列比对结果表明目标靶位点因插入或缺失碱基而发生了移码突变(图3)。记为细胞株1、细胞株2、细胞株3；其中，细胞株1是在野生型hmgb1基因的靶向敲除位点上有5个碱基缺失；细胞株2是在野生型hmgb1基因的靶向敲除位点上插入1个碱基；细胞株3是在野生型hmgb1基因的靶向敲除位点上有6个碱基缺失。hmgb1基因的具体敲除位点如下，以下序列依次对应：野生型、细胞株1、细胞株2、细胞株3：tgctctgagtatcgcccaaaaatcaaaggaga；tgctctgagtatcgcccaaaaa-----ggaga；tgctctgagtatcgcccaaaaattcaaaggaga；tgctctgagtatcgcccaaaaa-------gaga。2)westernblot(wb)验证基因蛋白敲除效果：①蛋白胶配制：将玻璃板洗净、晾干后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。按表1的比例配制10％或15％分离胶，加入temed(四甲基乙二胺)后立即摇匀和灌胶，待胶面达到绿带中间线高度即可；胶上加入异丙醇液封。分离胶充分凝固后，倒去胶上层异丙醇，并用滤纸吸干。按表2配制5％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀和灌胶；剩余空间灌满浓缩胶后，将梳子插入浓缩胶中，待到浓缩胶凝固后，轻轻将其拔出梳子。密封保存于4℃冰箱。表1分离胶配方组分10％(5ml)15％(5ml)h2o1.9ml1.1ml30％丙烯酰胺1.7ml2.5ml1.5mtris-hcl(ph8.8)1.3ml1.3ml10％sds50μl50μl10％过硫酸铵50μl50μltmemd2μl2μl表2浓缩胶配方组分5％(3ml)h2o2.1ml30％丙烯酰胺0.5ml1.5mtris-hcl(ph6.8)380μl10％sds30μl10％过硫酸铵30μltmemd3μl②上样和电泳：蛋白胶卡紧放入电泳槽后，往电泳槽加入1×sds-page电泳缓冲液，在蛋白胶的上样孔中按顺序加入5μlproteinladder和20μl蛋白样品。正确连接装置，80v电泳30min，120v电泳60min。至溴酚蓝刚好跑出蛋白胶即可停止电泳，进行转膜。③转膜：按蛋白胶的大小剪好nc膜和滤纸，放入转膜液中浸泡平衡10min。按三层滤纸、蛋白胶、nc膜、三层滤纸的顺序放置于转移夹内侧面，将转移夹扣紧按正确方向放入转膜仪中，即蛋白胶位于负极，nc膜位于正极。转膜仪置于冰上，在200ma恒定电流下转膜55min。④免疫印迹：转膜完成后，取出nc膜，用tbst缓冲液洗涤nc膜，加入含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h或4℃封闭过夜。弃去封闭液，tbst缓冲液洗涤nc膜三遍，每遍10min，加入以稀释的一抗(hmgb1兔多克隆抗体购自abcam，货号ab18256；β-actin兔多克隆抗体购自全式金公司，货号hc201-01)，室温孵育2h或4℃孵育过夜。回收一抗，tbst缓冲液洗涤nc膜三遍，每遍10min，加入1：10000稀释的山羊抗鼠的荧光二抗(800cwgoatanti-rabbitigg(h+l)购自licor化学免疫试剂公司)，室温孵育1h。回收二抗，tbst缓冲液洗涤nc膜三遍，每遍10min。使用odyssey双色红外激光成像系统扫描nc膜成像。用碧云天的裂解液裂解细胞，收集细胞株的细胞裂解液，检测结果显示hmgb1蛋白的表达已被完全敲除(图4)。其中，图4中的ko-hmgb1表示hmgb1基因敲除细胞株。实施例4hmgb1基因敲除细胞株的细胞形态观察hmgb1基因敲除细胞株(ko-hmgb1)与huh7正常细胞株同时连续传代的过程中，发现二者形态上没有显著的差异(图5)。在连续传代后，检测细胞的hmgb1蛋白的表达以及对该段基因组测序，发现构建的细胞株十分稳定。不难想象，该敲除细胞株具有较大的应用前景。实施例5hmgb1基因敲除细胞株在乙脑上的功能验证hmgb1基因敲除细胞株(ko-hmgb1)和huh7正常细胞株分别接种于12孔板中，24h后，以病毒量为0.1moi的乙型脑炎病毒sa14毒株(所述的sa14毒株在文献“一株强神经毒力乙脑病毒株的生物学及其分子特征.病毒学报.2010,4(26),265-270”中公开)接种。病毒接种48h后，收集细胞上清，置于-80℃冰箱保存。将病毒上清液接种于70～80％bhk-21(购自上海中科院细胞库)单层细胞的96孔板中，48h后弃去dmem，pbs缓冲液洗涤两遍，每孔加入50μl预冷甲醇，放置在-20℃固30min；弃去甲醇，pbs缓冲液洗涤三遍，每孔加入50μl一抗(jevns1蛋白单抗，定制于艾比玛特生物医药有限公司)，37℃孵育1h；弃去一抗，pbs缓冲液洗涤三遍，每孔加入50μlhrp耦连的二抗(羊抗鼠的辣根过氧化物酶affinipuregoatanti-mouseigg(h+l)，货号115-035-003)，37℃孵育30min；弃去二抗，pbs缓冲液洗涤三遍加入50μlaec显色工作液，37℃避光孵育30min；显色完成后，弃去显示液，pbs缓冲液洗涤两遍。在显微镜下观察细胞染色情况(乙型脑炎病毒不入核)，计数并计算tcid50。结果显示敲除细胞株中病毒滴度显著上升(图6)，说明乙型脑炎病毒能在该细胞株内大量增殖。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>华南农业大学<120>一种敲除人hmgb1基因的细胞株及其应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>靶向敲除人hmgb1基因的grna序列<400>1gagtatcgcccaaaaatcaa20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ghmgb1-f<400>2caccggagtatcgcccaaaaatcaa25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>ghmgb1-r<400>3aaacttgatttttgggcgatactcc25<210>4<211>648<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<220><223>hmgb1基因的编码序列<400>4atgggcaaaggagatcctaagaagccgagaggcaaaatgtcatcatatgcattttttgtg60caaacttgtcgggaggagcataagaagaagcacccagatgcttcagtcaacttctcagag120ttttctaagaagtgctcagagaggtggaagaccatgtctgctaaagagaaaggaaaattt180gaagatatggcaaaagcggacaaggcccgttatgaaagagaaatgaaaacctatatccct240cccaaaggggagacaaaaaagaagttcaaggatcccaatgcacccaagaggcctccttcg300gccttcttcctcttctgctctgagtatcgcccaaaaatcaaaggagaacatcctggcctg360tccattggtgatgttgcgaagaaactgggagagatgtggaataacactgctgcagatgac420aagcagccttatgaaaagaaggctgcgaagctgaaggaaaaatatgaaaaggatattgct480gcatatcgagctaaaggaaagcctgatgcagcaaaaaagggagttgtcaaggctgaaaaa540agcaagaaaaagaaggaagaggaggaagatgaggaagatgaagaggatgaggaggaggag600gaagatgaagaagatgaagatgaagaagaagatgatgatgatgaataa648当前第1页12