解旋白蛋白水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于具有良好生物相容性的医用水凝胶领域，更加具体地说，涉及以尿素为变性剂、以谷胱甘肽为还原剂制备的解旋蛋白水凝胶及其制备方法。

背景技术：

水凝胶具有三维网络结构并且含水量高，有很强的可变性，原位可注射水凝胶可将手术创伤降至最小，已被广泛用于药物运输和再生医学。用于制作凝胶的材料可分为天然材料和合成材料，但是天然材料由于自身结构的限制，往往机械性能较差。近年来，为改变这一情况，研究者通常采用两种方法：一是将两种蛋白或将蛋白与其他大分子复合制备双网络水凝胶，二是设计多肽，使其自组装形成水凝胶。但是这两种方法制备工艺复杂且不能保证凝胶的生物相容性。

牛血清白蛋白(bsa)，由于其良好的溶解性和生物相容性受到广泛关注，已有许多以bsa为原料制备的水凝胶，比如用含有特定基团的材料修饰bsa表面，使修饰后的bsa在生理条件下可形成凝胶，但这种方法操作复杂，制备过程中引入的物质过多且制备周期长；还有使用热变性bsa或者用二硫苏糖醇(dtt)还原的bsa制备的水凝胶，但是这些水凝胶往往力学性能差，而且不适用于人体条件，不能实现生理条件下的可注射。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，为了解决以天然高分子为原料制备的水凝胶力学性能差，以合成高分子为原料的水凝胶生物相容性差的问题，提出以bsa为原料制备可注射水凝胶的方法。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：

解旋白蛋白水凝胶及其制备方法，以牛血清白蛋白(bsa)为原料，尿素为变性剂，谷胱甘肽为还原剂进行制备，按照下述步骤进行：

步骤1，将牛血清白蛋白置于尿素的pbs溶液中，室温20—25摄氏度下进行震荡反应，以使牛血清白蛋白进行解旋，得到牛血清白蛋白的解旋溶液；其中pbs溶液为磷酸钠缓冲溶液，ph为7—8；将牛血清白蛋白置于尿素的pbs溶液中，每毫升pbs溶液中尿素和牛血清白蛋白的质量比为(1.5—5.5)：1；

在步骤1中，震荡反应时间为10—60min。

在步骤1中，pbs溶液的ph为7.5—8。

在步骤1中，尿素和牛血清白蛋白的质量比为(2.5—5)：1。

步骤2，向步骤1制备的牛血清白蛋白的解旋溶液中加入还原剂谷胱甘肽混合均匀后，在35—38摄氏度下进行恒温加热，以形成水凝胶，其中每毫升解旋溶液中谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.01—0.15)：1。

在步骤2中，在36—37摄氏度下恒温加热反应3—5min。

在步骤2中，谷胱甘肽和原料牛血清白蛋白的质量比为(0.05—0.12)：1。

在步骤2中，使用倒置法判断凝胶是否形成，将盛有溶液的装置(离心管)倒置10min，若无液体流动即认为已成胶。

本发明选用的材料：bsa，一种白蛋白，白蛋白是血清中含量最多的蛋白；尿素，常用作蛋白质变性剂，以研究蛋白质一级结构；谷胱甘肽是一种含巯基的三肽，广泛存在于人体细胞中，可还原二硫键，这三种材料均是理想的生物材料。因此，本发明以尿素为变性剂、以谷胱甘肽为还原剂将bsa中链内的二硫键还原为巯基，使其重新组装成链间的二硫键。使用这种方法制备的水凝胶，不仅有良好的生物相容性，而且制备工艺简单、在生理条件下可注射、力学性能良好。本发明制备了可原位注射、生物相容性好并且有一定力学强度的白蛋白水凝胶。上述水凝胶的凝胶时间可控制在5分钟内，凝胶溶液可以从针头中打出(实现可注射性能)，形成的凝胶呈透明淡黄色。从压缩和流变结果来看，其力学性能较好，压缩和储能模量均可达到kpa级别。本发明所用原料均存在于人体中，使用天然高分子为原料保证了水凝胶良好的生物相容性，细胞实验结果显示细胞存活率在90％以上。而且，本发明所采用的方法操作简单、原材料易得且无毒，合成成本低。

附图说明

图1是本发明中bsa解旋结构的稳态荧光光谱测试曲线图。

图2是本发明解旋白蛋白水凝胶从针管中打出的效果图。

图3是本发明解旋白蛋白水凝胶凝胶前后对比效果图。

图4是本发明解旋白蛋白水凝胶的力学测试曲线图。

图5是本发明解旋白蛋白水凝胶的流变测试曲线图。

图6是本发明解旋白蛋白水凝胶的细胞毒性测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

选择用ph＝8.0的pbs缓冲液进行尿素、牛血清白蛋白和谷胱甘肽的溶解和反应，首先进行bsa解旋结构的制备和表征，使用jobinyvinfluorolog3-21稳态荧光光谱仪进行表征，具体过程如下：(1)用ph＝8.0的pbs溶解尿素，尿素浓度为0-9m；(2)分别将10mgbsa溶解在1ml不同浓度的尿素溶液中，震荡反应10min；(3)取1ml(2)中的bsa溶液，加入0.003g谷胱甘肽，震荡10min；(4)在激发波长280nm条件下测试溶液最大发射波长及吸收强度。如图1所示，从图中可以看出吸收峰的最大发射波长在尿素浓度＜4m时未有明显变化，即bsa构象未发生明显改变；在4-5m时略有蓝移，这是由于色氨酸残基所处微环境的极性减小，疏水性增加，即bsa的结构变得更为紧密；在＞5m时红移，说明色氨酸残基所处的微环境疏水性降低，亲水性增强，bsa结构完全打开，符合尿素存在时蛋白结构变化。

然后进行解旋白蛋白水凝胶的制备，选择用ph＝8.0的pbs缓冲液溶解尿素，再向尿素溶液中加入bsa粉末，反应1小时使bsa完全解旋；最后加入谷胱甘肽粉末，使被尿素暴露出来的bsa中的17个二硫键打开，37℃恒温加热5min即可形成水凝胶，在每毫升ph＝8.0的pbs缓冲液溶中，尿素、谷胱甘肽和bsa的质量比(1)1.8:0.01:1；(2)2.7:0.015:1；(3)5.4:0.03:1，震荡反应选择震荡机械最高档为10挡进行处理即可。

压缩实验：使用dwd-05电子式万能材料试验机进行测试。按照发明内容制备3组直径在20mm、高度在10mm的圆形水凝胶，然后以5n/min的速度压缩凝胶。如附图4所示，表示水凝胶压缩性能的应力-应变曲线，从图中可以看出(1)以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝1.800：0.010：1制备的水凝胶的压缩应力最大，可达到0.2531mpa，但是应变仅为50％。(2)以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝5.400：0.030：1制备的水凝胶压缩应力最小仅为0.1120mpa，应变也只有53％。(3)以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝2.700：0.015：1制备的水凝胶的应变最大，可达60.7％，最大压缩应力为0.1505mpa，性能最佳。

流变实验：使用dhr-2流变仪测试水凝胶流变性能。按照发明内容制备3组直径在8-9mm、高度在6-10mm的圆柱形水凝胶。在37℃，固定应变10％，测试频率1-10hz范围内的储能模量。如附图5所示，图为表示水凝胶流变性能的模量-频率图，从图中可以看出：⑴以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝1.800：0.010：1制备的水凝胶的储能模量最大，可达到16000pa。(2)以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝5.400：0.030：1制备的水凝胶的储能模量最小，仅为6000pa。(3)以质量比尿素：谷胱甘肽：bsa＝2.700：0.015：1制备的水凝胶的储能模量可达到13500pa。因此，综合水凝胶的压缩性能与流变性能来看，三种原料以质量比2.700：0.015：1制备出的水凝胶力学性能最优。

使用mtt法测试水凝胶细胞毒性。原理为：活细胞的线粒体中有琥珀酸脱氢酶，这种酶可以使外源性3-(45-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)还原为蓝紫色结晶甲瓒并沉积在的细胞中，随后加入的二甲基亚砜(dmso)可以将甲瓒溶解，最后使用酶标仪测试其在490nm的吸光度，即可间接反映活细胞数量。本发明所使用的细胞为l929小鼠成纤维细胞，完全培养基是含10％血清+1％双抗(青霉素和链霉素混合液)的1640培养基。实验方法：(1)根据国家标准iso-10993-5，按照发明内容中的步骤制备原料质量比为尿素：谷胱甘肽：bsa＝1.800：0.010：1，加热时间5min的水凝胶，然后将其以15mg/ml的浸提率在37℃下浸提24h，取其上清液，再经0.22μm的微孔滤膜过滤即得浸提液。(2)取96孔板，以5×10³个/孔的密度加入细胞，然后每孔加入100μl浸提液，对照组中加入100μl完全培养基，将孔板置于5％co2，37℃的恒温烘箱中分别培养1天和3天。(3)每孔加入20ulmtt溶液(5mg/ml)，在上述恒温烘箱中继续培养4h。(4)终止培养后，吸去孔内培养液，然后每孔加入150uldmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。(5)使用biotec公司生产的多功能酶标仪测试其在490nm的吸光度。(6)将实验组数值除以对照组数值即可得到实验组的细胞存活率。如附图6所示，图为表示水凝胶生物相容性的细胞毒性图，从图中可以看出使用浸提液培养1天的细胞存活率为91.98％，培养3天的细胞存活率为92.56％，细胞毒性为一级，可以认为本发明解旋白蛋白水凝胶生物相容性好，即本发明的解旋白蛋白水凝胶在制备细胞支架材料中的应用。

如附图2所示，依照本发明方法制备的凝胶溶液可以从针头中打出，而且凝胶时间平均为3—5分钟，满足可注射的条件。如附图3所示，凝胶前后对比图，左图是混合均匀的凝胶溶液，有一定粘度和流动性；右图是凝胶形成之后，呈现透明的淡黄色，倒置后不会滴落。

根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现水凝胶的制备，且表现出与实施例基本一致的性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。