本发明属于生物医药领域，涉及一种慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒以及defa1b基因在制备慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒中的用途。
背景技术：
慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种常见的气流受限性呼吸系统疾病，其气流受限通常呈进行性发展，伴有吸入有害气体或颗粒后形成的慢性气道炎症反应。临床主要表现为呼吸困难和慢性咳嗽、咳疲。
世界范围内，各国慢阻肺的患病率变异性较大。一项针对拉丁美洲墨西哥城、蒙得维的亚等五大城市40岁以上人群的调查数据显示，慢阻肺的患病率从7.8％到19.7％不等；同时中国的慢阻肺形势也不容乐观，2007年的一份调查数据显示，在北京、天津、上海、广州等7个地区40岁及以上人群中慢阻肺患病率己达8.2％，其中男性的患病率甚至己经达到12.4％。尽管调查数据有竖差异，但是仍可以看出慢阻肺总体患病率形势的严峻。随着人口的老龄化、缺血性心脏病与感染性疾病死亡率的下降以及吸烟人口的增多，慢阻肺的死亡率也逐年增高。
世界卫生组织调查数据显示，2012年全球共有310万人死于慢阻肺，占全球总死亡人数的5.6％，慢阻肺成为2012年全球第3大死因，据全球疾病负担项目估计，到2020年慢阻肺将继续占据全球死亡原因第3位。与患病率、死亡率相应的还有慢阻肺带来的巨大经济和社会负担。欧盟2003年的数据显示，居民呼吸道疾病花费占整个医疗支出的6％，而其中慢阻肺相关费用占据了整个呼吸道疾病花费的56％。同样在2003年，美国国家心肺血液研究所估计美国公民全年慢阻肺相关的花费总额达321亿美元，其中与慢阻肺间接相关的花费达180亿美元。因此，做好慢阻肺的预防、诊断和治疗不仅有着医疗方面的意义，而且兼具着巨大的经济和社会意义。
技术实现要素：
本发明利用高通量测序技术发现defa1b基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中的表达较正常人存在差异，与正常人相比，defa1b基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中表达上调，通过检测defa1b基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有慢性阻塞性肺疾病、或判断该受试者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高低、或判断慢性阻塞性肺疾病患者预后复发与否。
本发明的目的在于提供defa1b基因在制备诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增defa1b基因和管家基因的引物对。所述sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。
上述技术方案中，所述pcr缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述pcr缓冲液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；在优选的实施方案中，扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’(seqidno.1)，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’(seqidno.2)；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’(seqidno.3)，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含m-mlv逆转录体系，该逆转录体系包含：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。
优选逆转录反应液包含：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mmdtt。
rna酶抑制剂可选用本领域常用的rna酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含rna提取试剂，rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明的另一目的在于提供一种诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒。所述诊断试剂盒包含sybrgreen聚合酶链式反应体系、用于扩增defa1b基因和管家基因gapdh的引物对。所述sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。
上述技术方案中，所述pcr缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，所述pcr缓冲液包含：25mmkcl，2.5mmmgcl2，200mm(nh4)2so4。
所述引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含m-mlv逆转录体系，该逆转录体系包含：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。
优选逆转录反应液包含：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mmdtt。
rna酶抑制剂可选用本领域常用的rna酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
优选地，本发明的诊断试剂盒还包含rna提取试剂，rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明还提供了利用上述诊断试剂盒诊断慢性阻塞性肺疾病的方法，所述方法包括：
(1)提取来自受试者血液样本rna；
(2)将步骤(1)获得的rna逆转录成cdna；
(3)在荧光实时定量pcr仪上将defa1b基因和管家基因进行扩增检测；
(4)通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量；
(5)与正常人相比，defa1b基因表达上调，诊断该研究对象患有慢性阻塞性肺疾病或者患有慢性阻塞性肺疾病的风险高，或诊断慢性阻塞性肺疾病患者预后复发。
步骤(1)的具体实施方法为：使用rna抽提试剂进行血液总rna的提取，详细步骤参照产品说明书进行。
步骤(2)的具体实施方法为：用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligo(dt)，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
步骤(3)的具体实施方法为：采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*42个循环。以sybr
green作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；扩增gapdh基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。
本发明的优点和有益效果在于：(1)本发明首次证明了defa1b基因与慢性阻塞性肺疾病相关，因此defa1b基因成为了诊断慢性阻塞性肺疾病的分子标志物，同时为研究慢性阻塞性肺疾病的分子机理提供新的思路。(2)利用检测基因表达的方式诊断慢性阻塞性肺疾病较现有技术中的使用方法更加灵敏，有利于疾病早期的诊断。
附图说明
图1显示利用qpcr检测defa1b基因在慢性阻塞性肺疾病患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选慢性阻塞性肺疾病患者和正常人的差异表达基因
1、临床研究对象：
选取慢性阻塞性肺疾病患者6例，其中男性3例，女性3例，年龄范围52-76岁，诊断标准均符合我国2007年修订的《慢性阻塞性肺疾病诊疗规范》。
诊断标准：任何患有呼吸困难、慢性咳嗽或多痰的患者，并且有暴露于危险因素的病史，行肺功能检查显示，在吸入支气管舒张剂后，表明存在气流受限，可以诊断为copd。
排除标准：①合并其它肺部疾病者，如支气管哮喘、肺间质纤维化、肺癌等；②有其它部位感染者；③伴有严重心脑血管疾病、糖尿病、血液系统疾病、恶性肿瘤、脏器功能衰竭、肝炎者；④患免疫系统疾病或者近期使用过免疫抑制剂者。
正常对照：选取体检的健康人6人，其中男性3人，女性3人，年龄范围52-76。
入选标准：无慢性咳嗽、咳痰、端息等病史；近期无上呼吸道感染、肺部感染史；无全身其他部位感染者；无其他肺部疾病者；近期未使用免疫抑制剂或者无全身免疫系统疾病者；无器官功能衰竭或者严重心脑血管疾病、肿瘤者；无过敏性疾病者。入选对象行肺功能检查均排除并与慢性阻塞性肺疾病组对比，在性别、年龄上差异均无统计学意义具有可比性。
所有研究对象均签署了知情同意书。
2、样本采集
所有研究对象于清晨空腹状态下，抽取外周静脉血10ml，edta抗凝。
3、血液样本总rna提取
使用百泰克血液rna提取试剂盒进行血液总rna的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液rls。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无rna酶的离心管中。
(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液re，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱ra，放入一个无rna酶的离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无rna酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、rna样品的质量分析
利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5μg，浓度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之间。
4、片段化rna
illumina平台是针对短序列片段进行测序，mrna平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将rna随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cdna
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。
6、连接adaptor
双链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。
7、ung酶消化cdna二链
在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。
8、illuminax-ten上机测序
illuminax-ten测序平台，进行2*150bp测序。
9、生物信息学分析
测序数据获得以后的rawdata分析过程如下所示：
(1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉n大于10％的reads；
(2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为grch38.p7，fasta和gff文件下载自ncbi；
(3)cuffquant定量mrna的表达量并标准化输出；
(4)在r环境下用degseq包比较对照组跟疾病组mrna的表达差异。显著差异mrna筛选条件：p-value<0.05。
10、结果
用以上标准筛选得到差异表达基因3296个，其中表达上调的基因1428个，表达下调的基因有1868个。
实施例2qpcr验证候选基因与慢性阻塞性肺疾病的关系
基于前期高通量测序的结果，根据pvalue的大小，我们选择defa1b基因(其表达在慢性阻塞性肺疾病患者中上调)进行验证。
1、研究对象：
按照实施例1的方法选择慢性阻塞性肺疾病患者35例，正常人30例。
2、血液总rna提取
使用百泰克血液rna提取试剂盒进行血液总rna的提取：
(1)取全血250μl(或0.25g)至rnase-free过滤柱中，13000rpm离心2分钟，收集下液，加入0.75ml裂解液rls。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤：4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转入一个新的无rna酶的离心管中。
(4)每1mlrls加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，rna存在于水相中。水相层的容量大约为所加rls体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱ra中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液re，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
(11)将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱ra，放入一个无rna酶的离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无rna酶的水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟，收集洗脱液。
3、测量总rna浓度及纯度
用nanovueplus仪器测量样本rna的浓度及纯度。
4、逆转录
用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
5、qpcr扩增检验
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl；扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；管家基因优选gapdh，扩增该基因的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃10s，60℃60s)*42个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量，结果如图1所示，与正常人相比，defa1b基因在慢性阻塞性肺疾病患者血液中上调，差异具有统计学意义(*p<0.05)。
实施例3慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒的制备
根据defa1b基因与慢性阻塞性肺疾病的相关性，可以通过检测defa1b基因的表达情况来诊断慢性阻塞性肺疾病是否发生，据此本发明提供了一种基于检测defa1b基因表达来诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系；扩增defa1b基因和gapdh基因的引物对。扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液成分为：25mmkcl，2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。
实施例4慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒的制备
根据defa1b基因与慢性阻塞性肺疾病的相关性，可以通过检测defa1b基因的表达情况来诊断慢性阻塞性肺疾病是否发生，据此本发明提供了一种基于检测defa1b基因表达来诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增defa1b基因和gapdh基因的引物对、m-mlv逆转录体系。扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。m-mlv逆转录体系组分为：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。逆转录反应液组分为：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2、50mm的dtt。rna酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。
实施例5慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒的制备
根据defa1b基因与慢性阻塞性肺疾病的相关性，可以通过检测defa1b基因的表达情况来诊断慢性阻塞性肺疾病是否发生，据此本发明提供了一种基于检测defa1b基因表达来诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增defa1b基因和gapdh基因的引物对、rna提取试剂。扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
实施例6慢性阻塞性肺疾病诊断试剂盒的制备
根据defa1b基因与慢性阻塞性肺疾病的相关性，可以通过检测defa1b基因的表达情况来诊断慢性阻塞性肺疾病是否发生，据此本发明提供了一种基于检测defa1b基因表达来诊断慢性阻塞性肺疾病的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：sybrgreen聚合酶链式反应体系、扩增defa1b基因和gapdh基因的引物对、m-mlv逆转录体系、rna提取试剂。扩增defa1b基因的正向序列5’-aaagcatccaggctcaag-3’，反向序列5’-ttccatagcgacgttctc-3’；扩增gapdh的正向引物序列为5’-aactctggtaaagtggatattg-3’，反向引物序列为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’。sybrgreen聚合酶链式反应体系包含pcr缓冲液、dntps、sybrgreen荧光染料。pcr缓冲液组分为：25mmkcl、2.5mmmgcl2、200mm(nh4)2so4。m-mlv逆转录体系组分为：t重复寡核苷酸oligo(dt)、逆转录反应液、m-mlv逆转录酶、rna酶抑制剂、dntps。逆转录反应液组分为：250mmtris-hcl(ph8.3)、375mmkcl、15mmmgcl2，50mmdtt。rna酶抑制剂为大肠杆菌表达的非竞争性抑制rna酶的重组蛋白酶。rna提取试剂包含trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110>中日友好医院
<120>defa1b基因在制备慢性阻塞性肺疾病的诊断工具中的用途
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aaagcatccaggctcaag18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ttccatagcgacgttctc18
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
ggtggaatcatattggaaca20