本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分析微量根尖细胞转录组的方法，解决了微量植物细胞进行转录组分析的难题。
背景技术：
转录组广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使rna、核糖体rna、转运rna及非编码rna；狭义上指所有mrna的集合。根据中心法则，遗传信息从dna(基因)转录到rna(转录本)再翻译成蛋白质，因此转录组是连接基因组遗传信息与生物功能蛋白质的必然纽带。转录水平的调控成为生物体最重要的调控方式，也是目前研究最多的调控方式。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。
根是植物吸收营养和水分的重要器官。通过转录组的手段进行植物根系研究，有助于解析植物生长发育、营养吸收和水分吸收和运输等内在的机制，为农业生产和粮食安全提供技术支撑。根尖的生长角度主要是由根尖上下侧细胞的不对称生长引起的，通过分析根尖上下侧细胞的转录谱，可以帮助解析根的生长角度形成等发育问题，为研究植物根的向性生长提供支持。
由于rna的稳定性远低于dna，rna更容易降解断裂，所以转录组分析的难度要高于基因组分析。在现今通用的高通量二代测序手段条件下，进行转录组分析时，对样品的纯度和浓度有一定的要求，比如总rna的od值应在1.8至2.2之间，电泳检测28s∶18s至少大于1.5；总rna样品总量不低于15ug。另外，转录组还不同于基因组的是，每个细胞在某个特定条件下的转录组情况都是不同的，每个细胞都有自己独特的转录谱。所以非常有必要进行微量并且最好是单细胞的转录组分析，以帮助研究者了解目标组织或者特定细胞的在某特定情况下的转录调控情况。但是由于植物细胞有细胞壁的存在，限制了rna的释放，因此现今的文献和专利未见对单个普通植物细胞进行转录组分析的方法报导。不过，在动物上的有较成熟的单细胞转录组分析方法(picellis，faridanior，
激光捕获显微切割技术是联合了显微放大和激光切割两项主要技术手段，可以在显微镜视野下准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。但是该技术不仅需要高尖端的设备和昂贵的耗材，在操作上还需要有丰富的经验，不太适合初学者进行操作。此外，应用激光捕获技术来获取微量细胞有几个不足：a、激光显微切割相关的设备昂贵，技术复杂，操作者需要有很丰富的操作经验才能完成；b、由于样品制作过程繁多，往往会造成rna损耗断裂严重，影响结果的准确性；c、在一些特殊样品中，无法保证原位取样，例如根尖等，没法标记细微样品的原始位置。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种不采用激光捕获显微切割技术进行微量根尖上下层细胞分离，并进行转录组分析的方法。该方法解决了根尖样品原始位置标记的问题；解决了简便分割微量细胞样品的问题；解决了微量细胞rna提取和预扩增的问题；解决了微量细胞转录组数据精确分析的问题。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种分析微量根尖细胞转录组的方法，所述方法包括如下步骤：
s1、挑选健康的植物种子胚朝下插入厚度为0.5-1厘米的透明凝胶板内，在28-33℃生长箱内发芽3天；
s2、切取0.5-1厘米根尖所在的透明凝胶块，保证根尖落在透明凝胶块中心；
s3、将透明凝胶块根尖所在的一面朝上，用彩色包埋液包埋透明凝胶块，迅速冷凝；
s4、将已冷凝的样品放入冰冻切片机的载物台上固定，开始修片至看见白色的根尖样品，开始正式切取样品；冰冻切片机的温度设为零下23-零下28摄氏度，切片的厚度设定为10-20微米；
s5、挑取根尖切片放入rna提取裂解液中，冰上抽真空使所述裂解液充分浸润根尖切片样品；
s6、进行总rna的提取；
s7、进行mrna反转录和线性预扩增，使原始的mrna以线性的方式进行扩增，浓度上达到二代测序的要求；
s8、进行质量检测、建库、上机测序，数据分析；数据分析时，根据基因的覆盖率，对每个基因采用各自不同覆盖度进行长度截取获得基因的表达量值。
由步骤s1-s3可知，本发明用透明凝胶(琼脂糖)培养幼苗，并连同根尖所在的琼脂胶块一起取样。一方面，琼脂糖胶可以作为根生长的基质，为根生长提供物理支持；另一方面，这样就不需要通过颜色等手段来标记根尖的原始位置，根尖所在的琼脂胶就指示了根的原始位置，位于琼脂胶底面的就是根尖的下侧面，远离琼脂胶底面的就是根尖的上侧面。
优选的，步骤s1中，所述透明凝胶板的透明凝胶选自琼脂糖胶、卡拉胶、魔芋胶和明胶。
优选的，所述透明凝胶选自琼脂糖胶。通过加热溶解琼脂粉，倒入水平放置的平板内，制作琼脂胶板，浓度为0.3-1.5％。
优选的，步骤s1中，所述透明凝胶板由溶入处理剂的透明凝胶制备而得；所述处理剂为激素、营养成分、重金属抑制剂中的一种或几种。
优选的，步骤s4中，冰冻切片机需到达设定温度后稳定30分钟之后，才能开始切片。
优选的，所述彩色包埋液是将化学性质稳定的色粉加入透明的原始包埋液中，混合均匀制备而得；所述色粉和原始包埋液的体积比为2-8％。
优选的，所述色粉为活性炭。在包埋液中加入活性炭。活性炭粉末是黑色的，与白色的根尖对比鲜明，有利于观察取样。另外，活性炭化学性质稳定，不易于起化学反应，因此不会影响后续的rna提取等反应。
优选的，步骤s3中，冷凝时间为2-5分钟。
优选的，步骤s5中，冰上抽真空的时间为8-15分钟。该步骤中，切片放入裂解液后，进行了抽真空操作；此操作使裂解液充分浸润样品，减少了提取过程rna的降解。
优选的，所述rna提取裂解液中有rna酶抑制剂，可防止rna降解。
优选的，步骤s6中，rna提取后还包括在agilentbioanalyzer2100上进行rna质量检测的步骤。通过该步骤了解rna质量和浓度情况。此外，rna提取可用市面上常用的rna提取试剂盒，无特别限定。
步骤s7中，采用了线性扩增的方法来增加原始mrna的拷贝数，保证了扩增前后不同基因间增加倍数的一致性。
步骤s8中，由于5’端降解比较厉害，导致基因组覆盖度较低，所以采用了一种新的方法进行基因表达量的估算。即按照每个基因覆盖度情况，编写代码，截取一定比率的3’端基因长度进行后续分析。
优选的，步骤s8中，对每个基因采用各自不同覆盖度进行长度截取包括：覆盖率高的，以较大比例进行基因长度的截取；覆盖率低的，以较低的比例进行基因长度的截取。这样得到的基因表达率更为真实，还原了rna降解造成的偏差。
优选的，对每个基因采用各自不同覆盖度进行长度截取具体为：基因覆盖度90％～100％对应的3’端截取基因长度比率为100％，基因覆盖度80％～90％对应的3’端截取基因长度比率为95％，基因覆盖度70％～80％对应的3’端截取基因长度比率为85％，基因覆盖度60％～70％对应的3’端截取基因长度比率为75％，基因覆盖度50％～60％对应的3’端截取基因长度比率为65％，基因覆盖度40％～50％对应的3’端截取基因长度比率为55％，基因覆盖度＜40％对应的3’端截取基因长度比率为50％。本发明根据基因的覆盖率，对每个基因采用各自不同覆盖度进行长度截取计算表达表，大大降低了5’端rna降解对表达量估算的影响。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、应用本方法，可以较简便的获取微量植物根尖细胞(大约100-1000个细胞)，并分析这些特定微量细胞的转录谱，为研究特定组织和细胞的表达谱提供了技术支撑，是进行精细植物细胞功能和遗传研究的必要条件。
2、简便：不需要激光显微切割相关的设备和技术，取样操作简单，费用低廉。
3、准确：应用线性扩增的方法进行rna的扩增，大大降低了pcr扩增过程带来的浓度变化；根据基因的覆盖率，对每个基因采用各自不同覆盖度进行长度截取，大大降低了5’端rna降解造成的表达量变异影响。
4、保证了原位取样：将根尖用琼脂胶固定，以琼脂胶的位置来确定根尖的位置，方便研究者取到目的位置的样品，例如向地侧和背离地侧的根尖细胞等，为研究植物根的向性生长提供帮助。
附图说明
图1为琼脂板胶示意图；其中，a为无盖的琼脂板胶，b为加盖的琼脂板胶；
图2为播种后的琼脂板胶示意图；
图3为生长3天的种子根示意图；
图4为放在载物台上的根尖样品示意图；
图5为切片前的包埋根尖示意图；
图6为基因分布情况示意图；
图7为根据转录组数据对12个样品进行聚类示意图；其中，z是珍汕97b样品，i是irat109样品，1，2，3是上层根尖细胞；4，5，6是下层根尖细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例
样品准备：
加热溶解琼脂粉，倒入水平放置的平板内，制作琼脂胶板，浓度为0.5％，琼脂厚度为1厘米，如图1所示。
挑选健康的珍汕97b和irat109的种子，清洗干净后胚朝下插入琼脂板内，如图2所示。然后在30℃生长箱内发芽3天，由于重力作用根尖会贴着容器的底壁生长，如图3所示。此外，根据需要也可以在琼脂胶中溶入一些处理剂，例如激素、营养成分、重金属抑制剂等进行研究
开启冰冻切片机，温度设为零下25摄氏度，切片的厚度设定为15微米，到达设定温度后稳定30分钟之后，才能开始切片。
准备黑色包埋液，将活性炭磨成细粉倒入透明的原始包埋液中，混合均匀，碳粉和包埋液的比例约为5％。活性炭细粉一方面可以在颜色上将白色根样品和黑色包埋液显著区分；另一方面活性炭化学性质不活泼，不会与样品或者试剂发生反应。
准备20微升picopuretmrna提取裂解液，放入200微升已灭菌的离心管内，再将离心管放置在冰上待用。
切取0.5厘米根尖所在的长方形琼脂块，大小约为0.5*1厘米，保证根尖落在琼脂块中心，如图4所示。将根尖所在的琼脂块一起取下，主要目的在于保持根尖细胞的原位性，可以根据原来的生长位置，例如上下左右等要求来切取样品。
将琼脂块根尖所在的那一面朝上，水平放置在载物台上，用黑色包埋液包埋琼脂块，迅速放入冷凝孔内凝固，冷凝大概需要5分钟。
样品获取：
将已冷凝的样品放入冰冻切片机的样品台上固定，打开防卷玻璃，开始修片直至看见白色的根尖样品，如图5所示。
盖上防卷玻璃，开始切片，用已灭菌的盖玻片粘取切片。
迅速用针尖挑取根尖切片放入已准备好的裂解液中，所用针尖使用前要在酒精灯上灼烧消毒灭菌。
将取好样品的离心管放在冰上抽真空10分钟，使裂解液充分浸润样品。裂解液中有rna酶抑制剂，可防止rna降解。
然后可放在零下20度冷冻储藏样品。
rna提取：
按照试剂盒的操作说明进行rna的提取(picopuretm的rna提取试剂盒)。
在agilentbioanalyzer2100上进行rna质量检测，了解rna质量和浓度情况。
用malbac方法进行mrna反转录和线性预扩增(chapmanar，hez，lus，etal.singlecelltranscriptomeamplificationwithmalbac[j].plosone，2015，10(3)：e0120889.)，使原始的mrna以线性的方式进行扩增，浓度上达到二代测序的要求。
转录组分析：
质量检测，建库，上机测序(illumina二代测序)。
数据分析。由于5’端降解比较厉害，导致基因组覆盖度较低(图6)，所以采用了一种新的方法进行基因表达量的估算。即按照每个基因覆盖度情况，编写代码，截取一定比率的3’端基因长度进行后续分析，详细规则如下表1：
表1
覆盖率高的，以较大比例进行基因长度的截取；覆盖率低的，就以较低的比例进行基因长度的截取，这样得到的基因表达率更为真实，还原了rna降解造成的偏差。
结果分析：
表2按照不同的方法进行转录组数据基因的匹配和定量
注：a，数据引自louq，chenl，meih，etal.roottranscriptomicanalysisrevealingtheimportanceofenergymetabolismtothedevelopmentofdeeprootsinrice(oryzasatival.)[j].frontiersinplantscience，2017，8：1314.
从上表2可知，按照覆盖度截取基因片段进行定量的方法与普通分析方法得到的结果近似，明显大于简单的取3’端500bp过滤后的基因数，说明用这种方法假阴性较低。另外，这种方法与足量根尖样品得到的基因数差异也不大，只少了大约10％左右的基因，说明这种方法得到的基因数较接近真实，样品的降解对结果影响不大。
由图7聚类情况可知，转录组数据对12个样品进行了很好的区分。所有珍汕97b样品聚在一起，所有irat109样品聚在一起。此外，同一个样品的上下层细胞一般都是成对的出现。说明这种方法进行根尖上下层细胞的转录组分析是有效可行的。