专利名称：用免疫荧光染色处理大豆根尖观察细胞微管骨架的方法
技术领域：
本发明涉及ー种用免疫荧光染色处理大豆根尖观察细胞微管骨架的方法，具体涉及ー种利用免疫荧光染色法处理大豆根尖观察根尖细胞微管骨架的方法，属于植物保护和细胞生物学领域。
背景技术：
病原菌与其寄主互作被认为是一场军备竞赛,在这场竞赛中，病原菌通过各种策略克服或抑制寄主防御反应，而寄主本身也利用各种策略识别和攻击入侵的病原菌或病原菌效应分子。病原菌与非寄主互作和与寄主互作间的定义差异是病原菌克服一系列障碍成功侵入寄主的能力。植物细胞骨架经常被认为是病原菌侵入寄主的一道障碍之一。细胞骨架在抵御病原菌入侵过程中的重要性可以通过ー些例子说明，如大麦、小麦、黄瓜和烟草的肌动蛋白细胞骨架被破坏后能被许多非寄主真菌穿透。病原菌成功侵入寄主通常需要经过6道障碍。越来越多的证据表明，细胞骨架參与的是寄主受病原菌侵入时形成的第3道障碍，主要是诱导诸如乳突和胼胝质形成、蛋白和碳水化合物积累甚至过敏性细胞死亡等障碍的生成。植物细胞骨架由肌动蛋白纤丝和微管组成、作为胞内物质运输的间接者扮演着至关重要的作用。二十世纪九十年代早期报道了第一例描述植物防御反应中细胞骨架作用的研究，发现当植物受到病原菌侵入吋，大量的寄主细胞极性化。在受到病原菌侵入的植物细胞中，观察到细胞质聚集点与细胞核移动方向一致，即都向侵入点移动。Kobayashi等人利用免疫细胞化学的方法研究非寄主病原豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)侵染大麦时的大麦胚芽鞘细胞微管组织结构时发现，在没有受到病原菌侵染的寄主细胞中，微管沿着细胞的 纵轴成横向排列，而在被病原菌侵染的细胞中，微管在侵入点聚集成放射网状。利用同样的免疫荧光技术也在一系列的包括亚麻与亚麻锈菌、大豆与大豆疫病菌、洋葱与葱腐葡萄孢以及大麦与大麦白粉菌在内的寄主与病原菌亲和互作中观察到寄主的微管和肌动纤丝朝着真菌和卵菌侵入点重新分布和排列。大麦胚芽鞘细胞与大麦非致病白粉菌互作相比，大麦胚芽鞘细胞与致病白粉菌的亲和互作中微管和肌动蛋白纤丝重新排列的速度明显减缓，同样对其它致病系统的研究也发现了类似结果，明显的证据支持了植物细胞骨架在植物防御反应中的作用，同时也表明亲和病原菌会干扰细胞骨架的重新排列。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术不足，而提供一种快速、简便、准确地用免疫荧光染色方法观察大豆根尖细胞微管骨架的方法。发明的技术方案是保持现有免疫荧光染色和观察方法不变，包括荧光抗体种类和用量、所用共聚焦显微镜的激发光和发射光波长范围均与常规相同，用免疫荧光染色方法处理1-10天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架；所述免疫荧光染色方法处理方法为将大豆根尖放入固定液抽气lOmin，室温固定Ihr ;固定完毕后用PEMT洗三次，每次IOmin ;37°C条件下酶解Ihr ;酶解后PEM冲洗三次，每次IOmin ;用O. IM PBS (pH7. 2)溶液配制NaBH4,使其浓度为lmg/ml,再用配制好的lmg/ml的NaBH4处理大豆根尖20min ;室温用50mM Gly封闭30min ;加ー抗，4°C过夜，冲洗ー抗PBS冲洗三次，每次IOmin ;加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr ;冲洗二抗PBS冲洗三次，每次IOmin ;加上抗荧光淬灭剂后，封片。本发明的有益效果在于方法简便、准确、快速。利用免疫荧光染色的方法处理大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架，能直接定性地掌握大豆根尖细胞微管骨架排列方式。免疫荧光染色法直接处理和观察水稻根尖细胞微管骨架排列能有效避免诸如免疫荧光染色处理和观察叶片细胞微管骨架时步骤繁琐且容易受到残留叶绿素的干扰，同时为进一歩研究土壌病原菌与植物根组织互作时细胞微管骨架对病原菌响应的观察提供有效简单的方法。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例一免疫荧光染色法处理I天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。具体方法为将大豆根尖放入固定液(4%多聚甲醛，O. 1%戊ニ醛，百分比均为质量百分比，下同)抽气lOmin，室温固定lhr。固定完毕后用PEMT (O. 05% Triton χ-100)洗三次，每次lOmin。37°C条件下酶解lhr，PEM配制，I %果胶酶，I. 5 %纤维素酶，O. 4M甘露醇。酶解后PEM冲洗三次，每次lOmin。用O. IM PBS (pH7. 2)溶液配制NaBH4，使其浓度为lmg/ml, (PBS配制NaBH4的缓冲液)再用配制好的lmg/ml的NaBH4处理大豆根尖20min。室温用 50mM Gly 封闭 30min。加ー抗(β-tubulin—抗 I : 800，AtMAP18—抗 I : 100)，4°C过夜，冲洗一抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr。冲洗二抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加上抗荧光淬灭剂后，封片。结果在根尖的根冠、分生区和伸长区的皮层细胞都观察到了微管骨架。实施例ニ免疫荧光染色法处理3天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。将大豆根尖放入固定液(4%多聚甲醒O. 1%戍ニ醒)抽气IOmin,室温固定lhr。固定完毕后用ΡΕΜΤ(0. 05% Triton χ-100)洗三次，每次lOmin。37°C条件下酶解lhr，PEM配制1%果胶酶，I. 5%纤维素酶，0. 4M甘露醇。酶解后PEM冲洗三次，每次lOmin。用Img/ml NaBH4 (PBS 配制)处理 20min。室温用 50mM Gly 封闭 30min。加一抗(β-tubulin —抗I : 800,AtMAP18—抗I : 100)，4°C过夜冲洗一抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr。冲洗二抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加上抗荧光淬灭剂后，封片。结果在根尖的根冠、分生区和伸长区的皮层细胞都观察到了微管骨架。实施例三免疫荧光染色法处理5天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。
将大豆根尖放入固定液(4%多聚甲醒O. 1%戍ニ醒)抽气IOmin,室温固定lhr。固定完毕后用ΡΕΜΤ(0. 05% Triton χ-100)洗三次，每次lOmin。37°C条件下酶解lhr，PEM配制，I %果胶酶，I. 5%纤维素酶，O. 4M甘露醇。酶解后PEM冲洗三次，每次lOmin。用Img/ml NaBH4 (PBS 配制)处理 20min。室温用 50mM Gly 封闭 30min。加一抗(β-tubulin —抗I : 800,AtMAP18—抗I : 100)，4°C过夜冲洗一抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr。冲洗二抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加上抗荧光淬灭剂后，封片。结果在根尖的根冠、分生区和伸长区的皮层细胞都观察到了微管骨架。实施例四免疫荧光染色法处理7天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。
将大豆根尖放入固定液(4%多聚甲醒0. 1%戍ニ醒)抽气IOmin,室温固定lhr。固定完毕后用PEMT (0. 05% Triton χ-100)洗三次，每次lOmin。37°C条件下酶解lhr PEM配制，I %果胶酶，I. 5%纤维素酶，0.4M甘露醇。酶解后PEM冲洗三次，每次lOmin。用Img/ml NaBH4 (PBS 配制)处理 20min。室温用 50mM Gly 封闭 30min。加一抗(β-tubulin —抗I : 800,AtMAP18—抗I : 100)，4°C过夜冲洗一抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr。冲洗二抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加上抗荧光淬灭剂后，封片。结果在根尖的根冠、分生区和伸长区的皮层细胞都观察到了微管骨架。实施例五免疫荧光染色法处理10天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架。将大豆根尖放入固定液(4%多聚甲醒0. 1%戍ニ醒)抽气IOmin,室温固定lhr。固定完毕后用PEMT (0. 05% Triton χ-100)洗三次，每次lOmin。37°C条件下酶解lhr PEM配制，I %果胶酶，I. 5%纤维素酶，0.4M甘露醇。酶解后PEM冲洗三次，每次lOmin。用Img/ml NaBH4 (PBS 配制)处理 20min。室温用 50mM Gly 封闭 30min。加一抗(β-tubulin —抗I : 800,AtMAP18—抗I : 100)，4°C过夜冲洗一抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr。冲洗二抗PBS冲洗三次，每次lOmin。加上抗荧光淬灭剂后，封片。结果在根尖的根冠、分生区和伸长区的皮层细胞都观察到了微管骨架。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.ー种用免疫荧光染色处理大豆根尖观察细胞微管骨架的方法，其特征在于，用免疫荧光染色方法处理1-10天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架；所述免疫荧光染色方法处理方法为将大豆根尖放入固定液抽气lOmin，室温固定Ihr ;固定完毕后用PEMT洗三次，每次IOmin ;37°C条件下酶解Ihr ;酶解后PEM冲洗三次，每次IOmin ;用O. IM PBS (pH7. 2)溶液配制NaBH4，使其浓度为lmg/ml，再用配制好的lmg/ml的NaBH4处理大豆根尖20min ;室温用50mM Gly封闭30min ;加ー抗，4°C过夜，冲洗ー抗PBS冲洗三次，每次IOmin ;加ニ抗(I 600)，37°C、闭光条件下，3hr ;冲洗二抗PBS冲洗三次，每次IOmin ;加上抗突光淬灭剂后,封片。
全文摘要
本发明公开了一种用免疫荧光染色处理大豆根尖观察细胞微管骨架的方法，用免疫荧光染色方法处理1-10天的大豆根尖，共聚焦显微镜观察根尖皮层细胞微管骨架；方法简便、准确、快速。
文档编号G01N33/533GK102692497SQ20121019144
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘林, 施竹凤, 朱有勇, 李成云, 杨静 申请人:云南农业大学