本发明涉及诊断药物性耳聋的方法，特别涉及一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的探针、试剂盒和方法。
背景技术：
：在我国，氨基糖甙类药物如庆大霉素、卡那霉素和链霉素等，由于抗菌谱广、价格低廉、使用方便，仍为临床上普遍使用的一线抗生素。但是，该类药物有严重的耳毒副作用。某些易感个体仅应用正常剂量或微量的此类药物就可能在极短的时间里诱发听力损失，出现不同程度的感音神经性耳聋。据调查，耳聋患者中约有3.4％是由于使用了氨基糖甙类抗生素的耳毒性药物而致。研究表明，线粒体dna(mitochondriadna，mtdna)12srrna基因突变导致的非综合征型遗传性耳聋与氨基糖甙类抗生素具有密切关系。1993年prezant等首先在一个非综合征性母系遗传耳聋的阿拉伯-以色列家系中发现mtdna12srrna基因中a1555g突变；2004年赵辉等对一个氨基糖甙类药物性聋和非综合征聋的母系遗传性中国大家系进行遗传学分析时发现了mtdnac1494t突变。这两个突变均位于mtdna12srrna上，在12srrna高度保守的a位形成了1994c-g1555或者1494u-a1555碱基对，这些改变使得人类12srrna二级结构与细菌16srrna的二级结构非常相似，使线粒体dna与氨基糖甙类药物结合更加容易，氨基糖甙类药物在耳蜗或前庭积累，与突变的线粒体相互作用，抑制线粒体蛋白合成，这些线粒体的翻译缺陷导致耳蜗和前庭内atp的产量下降，导致细胞死亡从而出现听力损失。线粒体dna属母系遗传，进行相关突变位点的基因诊断，可以进行用药指导和后代遗传性耳聋发病的风险评估。若为此基因突变携带者，终生不得使用氨基糖甙类抗生素。携带mtdna12srrna基因女性及其家族里的成员应进行检测，提供具体的遗传咨询和用药指导，从而避免使用氨基糖甙类抗生素，减少易感致聋的发生。目前已知与药物性耳聋相关的mtdna12srrna基因突变位点有：m.1494c＞t、m.1555a＞g、m.1095t＞c、m.7445a＞g、m.7444g＞a、m.7472insc、m.7510t＞c、m.7511t＞c等，其中m.1494c＞t和m.1555a＞g突变较常见，人群携带率分别为0.45％和3.43％。因此，开展mtdnam.1494c＞t和m.1555a＞g突变检测，对高危人群进行遗传咨询并采取相应的预防措施，是有效避免和降低药物性耳聋发生的重要途径。目前药物性耳聋的检测方法主要有限制性片段长度多态性、荧光定量pcr、高效液相色谱法和直接测序法等。但这些技术操作繁琐，不能多位点同时检测，或设备昂贵，对技术人员要求高，难在临床广泛推广。直接测序是检测点突变的金标准，但耗时长、成本高，不适用于人群大规模筛查。生物芯片(biochip)是以玻片、硅为载体，在单位面积上高密度地排列大量的生物探针(如抗原、抗体、核酸、酶等)，从而达到一次实验同时检测多种病原或分析多种生物样品的目的。生物芯片按检测载体可分为固相芯片和液相芯片。液相芯片技术也称悬浮阵列技术(suspensionarraytechnology)，其检测原理是用两种荧光染料编码微小的聚苯乙烯小球(直径约5.6um)，通过调节这两种荧光染料的不同比例最多可获得100种不同荧光谱的微球，每种颜色的荧光编码微球共价交联上1种特定检测物的生物探针(探针通过氨基与羧基结合到微球表面)，将针对不同检测物的编码微球混合，加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的探针进行特异性结合，用激光流式仪检测进行分析，通过红、绿两束激光分别识别微球的编码和检测微球上报告分子的荧光强度，得出直观的定量分析结果。与固相基因芯片相比较，它具有高通量、高重复、反应快速、无需洗涤、数字信号、客观可靠等优点，已广泛用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体、配体识别分析等研究，于核酸分子诊断的应用已是十分成熟。已有多家公司基于此技术平台开发出了多种基因芯片，目前未见有用液相芯片检测药物性耳聋的报道，国内外也未见同类产品上市。技术实现要素：本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的探针。本发明的另一目的在于提供一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的pcr引物。本发明的又一目的在于提供一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的试剂盒。本发明的再一目的在于提供一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的探针，所述的探针序列如下，探针5’末端进行aminolinkerc12修饰：1494n：5’-gcccgtcaccctcctcaag-3’；1494m：5’-gcccgtcactctcctcaag-3’；1555n：5’-atagaggagacaagtcgta-3’；1555m：5’-atagaggaggcaagtcgta-3’；其中，n为针对野生型的探针，m为针对突变型的探针。一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的pcr引物，所述的pcr引物序列如下，在与上述探针互补的一条链的pcr引物的5’端进行生物素修饰：for：5’-ccccagaaaactacgatagcc-3’；rev：5’-gtggccaagcgctgtatcccgagtatctcccaggtttcaatttctatcgccta-3’。其中，for表示上游引物，rev表示下游引物。一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的试剂盒，包括所述的pcr引物和所述的探针。所述的基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的试剂盒，还包括荧光编码微球。所述的基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的试剂盒，包括所述的pcr引物和液相芯片，其中，液相芯片为4种偶联好探针的荧光编码微球混合得到。所述的液相芯片优选为通过如下方法制备得到：将所述的探针分别与不同颜色的荧光编码微球进行偶联，然后将偶联好探针的荧光编码微球混合，再分散到tmac杂交液中，得到液相芯片。所述的tmac杂交液为1.5×tmac杂交液。所述的1.5×tmac杂交液的组成物质的终浓度如下：4.5m的tmac(四甲基氯化氨)，质量体积比0.15％的十二烷基肌氨酸钠，ph8.0、75mm的tris-hcl和ph8.0、6mm的edta。所述的液相芯片中每种偶联好探针的荧光编码微球的浓度为100个/μl。所述的荧光编码微球优选为美国luminex公司的表面羟基修饰的微球。所述的偶联好探针的荧光编码微球优选为通过如下步骤制备得到：将荧光编码微球与mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)溶液混匀，得到偶联体系；接着在偶联体系中加入探针和二氯乙烷(edc)，避光反应，得到偶联好探针的荧光编码微球。所述的mes溶液优选为0.1m(m表示mol/l)、ph4.5的mes溶液。所述的探针的浓度优选为0.1nmol/ul。所述的探针的添加量按其在偶联体系中的终浓度为0.02mm计算。所述的二氯乙烷的浓度优选为10mg/ml。所述的二氯乙烷的添加量按其在偶联体系中的终浓度为0.8～1mg/ml计算。所述的避光反应优选通过如下步骤实现：在偶联体系中加入探针和二氯乙烷(edc)，避光反应30min，然后加入二氯乙烷(edc)，再次避光反应30min。所述的偶联好探针的荧光编码微球的制备方法还包括洗涤的步骤。所述的洗涤为依次用吐温-20(tween-20)溶液和十二烷基硫酸钠(sds)溶液进行洗涤。所述的吐温-20溶液的浓度为体积百分比0.02％。所述的十二烷基硫酸钠溶液的浓度为质量体积比0.1％。所述的偶联好探针的荧光编码微球优选为置于4℃条件下、ph8.0的1×te溶液中避光保存。所述的荧光编码微球优选为去除上清后的荧光编码微球，其具体步骤如下：将荧光编码微球转移到离心管中，用磁力分离管分离，去除上清。一种基于液相芯片系统诊断药物性耳聋的方法，包括如下步骤：(1)提取目的基因组dna；(2)pcr扩增：利用上述pcr引物对目的基因组dna进行扩增，得到扩增产物；(3)杂交：将扩增产物与液相芯片进行杂交，得到杂交产物；(4)往杂交产物中加入藻红蛋白，混匀(对杂交产物进行标记)，再通过液相芯片检测仪读出检测结果并进行判断，判断标准如下：①m.1494c＞t突变判读标准：a正常标本：正常探针(n)和突变探针(m)比值≥1.80；b异质性突变标本：0.80≤正常探针和突变探针比值≤1.30；c匀质性突变标本：正常探针和突变探针比值≤0.50；d若正常探针和突变探针比值不在此判断范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(重复检测或sanger测序确证)；②m.1555a＞g突变判读标准：a正常标本：正常探针(n)和突变探针(m)比值≥1.80；b异质性突变标本：0.70≤正常探针和突变探针比值≤1.30；c匀质性突变标本：正常探针和突变探针比值≤0.50；d若正常探针和突变探针比值不在此判断范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(重复检测或sanger测序确证)。步骤(2)中所述的目的基因组dna的提取采用常规方法提取。步骤(2)中所述的pcr反应体系为20ul反应体系：10～20ng/ul的目的基因组dna2ul，pcrbuffer2ul，dntp1.8ul，100um的for引物和100um的rev引物各0.05ul、taq酶0.3ul，tag-biotin0.35ul，dutp0.03ul，udg酶0.02ul，5m甜菜碱3ul，加水补足。步骤(2)中所述的pcr扩增条件为：95℃10分钟；95℃30秒、52℃45秒、72℃45秒，30次循环；95℃45秒、65℃45秒、72℃45秒，25次循环；72℃5分钟。步骤(3)中所述的液相芯片为将4种偶联好探针的荧光编码微球分散在1.5×tmac杂交液中获得。步骤(4)中所述的进行杂交的体系为50μl杂交体系：液相芯片47.5μl，扩增产物2.5μl。步骤(4)中所述的杂交的反应条件优选为：95℃变性5min后，60℃杂交15min。步骤(4)中所述的藻红蛋白优选为链霉亲和素r-藻红蛋白(streptavidin，r-phycoerythrinconjugate，sape)。所述的链霉亲和素r-藻红蛋白(sape)为用1×tmac杂交液稀释后的链霉亲和素r-藻红蛋白。所述的链霉亲和素r-藻红蛋白的用量优选为按每ul1×tmac杂交液配比0.0016μg链霉亲和素r-藻红蛋白计算。所述的1×tmac杂交液中各物质的终浓度如下：3mtmac，体积百分比0.1％的十二烷基肌氨酸钠溶液，ph8.0、50mm的tris-hcl，ph8.0、4mm的edta。步骤(4)所述的液相芯片检测仪为magpix200系统检测仪。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：1、本发明设计出用于诊断线粒体相关药物性耳聋基因缺陷的探针，这些探针与不同编码的荧光微球交联、混合后得到诊断药物性耳聋的液相芯片。2、本发明通过将待检样品用本发明的特异性引物进行pcr扩增后，得到生物素标记的产物，然后与本发明的液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。3、本发明通过将待检样品用本发明的特异性引物(其中一条5’末端生物素biotin修饰)进行多重pcr扩增后，得到生物素标记的产物，然后与本发明的液相芯片进行杂交，再用藻红蛋白进行荧光标记，最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。4、本发明的方法具有如下的优点：①高通量、多指标的同时检测：一次分析可同时检测96个样品，可对同一样品中的多个指标同时进行分析，这与传统方法的逐个检测相比，检测效率大大提高。②结果稳定可靠，每种指标在一个反应体系中有2000-5000颗相同的微球，检测时抽取其中的100-500颗微球读数并求平均值，保证结果稳定，准确性高，重复性好。③自动化程度高，检测耗时短，整个反应可以在96孔板中完成，一次可以同时检测96个样品；操作步骤简单，整个反应过程只涉及加样、孵育和杂交，最后上机读数，中间手工操作步骤少，简单易用；整个检测流程能在6个小时内完成。④可进行精确的定性和定量分析，检测结果为数据信号，结果判读更客观。⑤样品需要量少，每次反应只需20ng的dna即可，并可用血片提取dna进行检测。4、本发明所述的试剂盒包括pcr引物和特异性探针，能同时检测线粒体dna12srrna基因m.1494c＞t和m.1555a＞g两个突变位点，该方法通量高、灵敏度好、特异性强、操作简单、结果直观，易于临床推广和应用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1本发明基于液相芯片技术，建立了一种诊断药物性耳聋基因突变位点的方法。本发明利用液相芯片技术，运用生物信息学知识和相关的生物信息学软件，对药物性耳聋基因突变位点进行序列分析，设计出针对药物性耳聋基因突变片段的pcr引物和特异性探针，pcr引物反向5’末端进行生物素修饰；特异性探针通过与荧光编码微球进行偶联制成特异性检测微球，即液相芯片。液相芯片能够特异性的识别药物性耳聋基因缺陷片段，经过多重pcr扩增后与液相芯片杂交，最后通过液相芯片检测仪读出检测结果。具体如下：(一)设计引物从ncbi的genbank上下载药物性耳聋的2个常见突变位点的核酸序列，设计的1对pcr引物(如表1所示)和探针序列(如表2所示)，其中在与探针互补的链的pcr引物(上游引物或下游引物)的5’端进行生物素修饰，探针5’末端进行aminolinkerc12修饰。表1pcr引物序列(均为5’-3’)注：pcr引物序列见表1，表中的f表示上游引物，r表示下游引物。表2探针序列(均为5’-3’)探针名称探针序列1494ngcccgtcaccctcctcaag1494mgcccgtcactctcctcaag1555natagaggagacaagtcgta1555matagaggaggcaagtcgta注：表中n为针对野生型探针，m为针对突变型的探针。(二)制备液相芯片将荧光编码微球(美国luminex公司，微球)与上述探针分别偶联，然后根据检测目的将偶联好探针的荧光编码微球混合，得到液相芯片；具体过程为：(1)取出25μl(6.25×104个)美国luminex公司研制的表面羟基修饰的微球，转移到1.5ml的离心管中，用磁力分离管分离，去除上清，在沉淀中加入5μl0.1m、ph4.5的mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)溶液，混匀，得到偶联体系；其中，偶联体系中微球的浓度为2×104个/μl；(2)将探针按1nmol/ul的浓度溶于去离子水，按1∶10稀释成0.1nmol/ul的溶液。(3)在步骤(1)中得到的偶联体系中加入1μl步骤(2)中得到的溶液，然后加入2.5μl10mg/mledc(二氯乙烷)，混匀，避光放置30min；再次加入2.5μl10mg/mledc，混匀，避光放置30min。最后用0.2ml体积百分比0.02％吐温20(tween-20)和质量体积比0.1％的sds(十二烷基硫酸钠)溶液分别各洗一次，最后将微球重新悬浮于10μl1×te(ph8.0，其物质组成是10mmtris-hcl、1mmedta)溶液中，得到偶联好探针的荧光编码微球。其中，探针在偶联体系中的终浓度为0.02mm，二氯乙烷在偶联体系中的终浓度为0.8～1mg/ml。该偶联好探针的荧光编码微球置于ph8.0、1×te溶液中于4℃避光保存。(4)参考上述步骤，将探针分别与4种不同颜色的荧光编码微球偶联，然后将4种偶联好探针的荧光编码微球混合，使用1.5×tmac(组成的物质终浓度如下：4.5m的tmac(四甲基氯化氨)，质量体积比0.15％的十二烷基肌氨酸钠，ph8.0的75mmtris-hcl和ph8.0的6mmedta)稀释，使每种微球的浓度分别为100个/μl，得到液相芯片，于4℃避光保存。其中，各探针偶联相对应的荧光编码微球编号见表3。表3探针偶联的磁珠编码探针位点磁珠编码1494nbeadregion54#beads1494mbeadregion63#beads1555nbeadregion55#beads1555mbeadregion64#beads(三)标本检测从标本中提取基因组dna，根据检测目的选择上述pcr引物同时进行2个位点耳聋基因片段扩增，得到相应的pcr扩增产物；接着将pcr扩增产物混合后与所述的液相芯片进行杂交，得到杂交产物；再用链霉素化藻红蛋白(sape)对杂交产物进行标记，通过液相芯片检测仪读出检测结果，其具体步骤如下：(1)pcr扩增待测样品对4例已知基因型的药物性耳聋dna标本和1例经测序证实为野生型dna标本(使用厦门致善生物dna抽提试剂盒(致善生物，厦门，中国)从受检者外周血中提取基因组dna，各操作步骤按说明书进行)进行检测：pcr反应体系总体积为20ul：待检样品基因组dna2ul(浓度10ng/ul～20ng/ul)，pcrbuffer2ul，dntp1.8ul，各引物体积0.05ul(浓度100um)，taq酶0.3ul，tag-biotin0.35ul，dutp0.03ul，udg0.02ul，5m甜菜碱3ul，其余用纯化水补足。pcr扩增条件为：95℃10分钟；(95℃30秒、52℃45秒、72℃45秒)×30次循环；(95℃45秒、65℃45秒、72℃45秒)×25次循环；72℃5分钟。(2)扩增产物与液相芯片的杂交将pcr产物与步骤(二)制备的液相芯片进行杂交，杂交体系为50μl，其中含液相芯片47.5μl(47.5μl分散于1.5×tmac杂交液稀释混合的偶联好探针的荧光编码微球)，pcr产物2.5μl。杂交的反应条件为：95℃变性5min后，60℃杂交15min，循环1次。加入25μl1×tmac杂交液稀释的0.04μg链霉亲和素r-藻红蛋白(streptavidin，r-phycoerythrinconjugate，sape)，混匀，60℃杂交7min，得到杂交产物；其中，1×tmac杂交液中各物质的终浓度如下：3mtmac、体积百分比0.1％十二烷基肌氨酸钠溶液、ph8.0的50mmtris-hcl、ph8.0的4mmedta。(3)上机检测经过一系列的实验探索评估引物和探针性能，并确定突变位点的检测探针的截断值(cut-offvalue)，如表4所示。表4突变位点的检测探针的截断值名称匀质突变异质突变野生型m.1494c＞t0.500.80-1.301.80m.1555a＞g0.500.70-1.301.80使用magpix200系统检测仪对杂交产物进行检测，参数设置为count100；doubletdiscriminatorgatevalue为5437-24807)，仪器读出各探针荧光信号值mfi，通过luminex附带xponent3.1数果，若正常探针(n)和突变探针(m)的比值不在此判断范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(重复检测或sanger测序确证)，判断标准为：①m.1494c＞t突变判读标准：a正常标本：正常探针(n)和突变探针(m)比值≥1.80；b异质性突变标本：0.80≤正常探针和突变探针比值≤1.30；c匀质性突变标本：正常探针和突变探针比值≤0.50；d若正常探针(n)和突变探针(m)比值不在此判断范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(重复检测或sanger测序确证)。②m.1555a＞g突变判读标准：a正常标本：正常探针(n)和突变探针(m)比值≥1.80；b异质性突变标本：0.70≤正常探针和突变探针比值≤1.30；c匀质性突变标本：正常探针和突变探针比值≤0.50；d若正常探针(n)和突变探针(m)比值不在此判断范围内的标本的突变类型可疑，需进一步确证(重复检测或sanger测序确证)。结果如表5所示：表54例药物性遗传性耳聋标本和1例野生型标本的检测结果样本1494n/m1555n/mm.1494c＞t异质突变1.014.16m.1494c＞t匀质突变0.433.11m.1555a＞g异质突变2.780.9m.1555a＞g匀质突变3.020.18野生型3.532.78可见，本发明能准确检出药物性耳聋匀质性突变个体和野生型个体。使用本发明所述的方法和试剂盒，全过程只需6小时，整个反应过程只涉及加样、孵育和杂交，最后上机读数，操作步骤少。对于大样本量检测更具有优势。应用本发明所述的方法和试剂盒对11例样本进行了检测，经dna测序验证结果一致。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12