本发明涉及嘧啶类化合物，组合物及其在治疗淋巴瘤白血病中的用途，属于医药
技术领域：
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背景技术：
：蛋白酪氨酸激酶(proteintyrosinekinase,ptks)通过控制细胞的信号传导通路调节细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理生化过程。受体型酪氨酸激酶是一类横跨细胞膜相对较大的激酶，其具有配体结合的胞外结构域、跨膜结构域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸残基并且由此影响细胞增殖的胞内结构域。在一般人类癌症中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已发现所述激酶的异常表达。蛋白酪氨酸激酶已成为抗肿瘤药物研究开发的重要靶点之一。布鲁顿酪氨酸激酶(btk)是一种胞浆蛋白，非受体蛋白酪氨酸激酶tec家族，其表达于多数造血细胞，如b细胞、肥大细胞、巨核细胞等，但在t细胞、nk细胞和浆细胞中不表达。在bcr信号通路中，随着bcr的激活，btk依赖syk、lyn活化，活化后的btk可以进一步磷酸化plcγ2，进而引起包括mapk、nfκb等下游信号的活化。btk在b淋巴细胞的生成过程中起着不可替代的作用。btk可以通过激活细胞周期正向调控因子和分化因子来控制b细胞的发育、分化，也能通过调节促凋亡和抗凋亡蛋白的表达来控制b细胞的存活和增殖。btk的持续激活是慢性淋巴细胞白血病(cll)发展的一个先决条件，bcr-btk信号传递异常会促进弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)中活化b细胞亚型的存活。btk小分子抑制剂对于治疗血液恶性肿瘤和自身免疫失调疾病具有良好前景。鉴于治疗癌症的迫切需要，本领域有必要开发新的效果更加良好的药物。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，该类化合物具有良好的抗肿瘤活性。本发明的另一目的在于提供含所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的再一目的在于提供所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，或所述组合物的用途。为此，一方面，本发明提供一种通式(ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，所述通式(ⅰ)所示的化合物具有如下结构：其中，r选自氢、氯、氟或三氟甲基；r1选自氢、甲基、氟或氯；m选自作为本发明的一些具体实施方式，本发明所述通式(i)所示的化合物具有i-1～i-20所示的结构：如上所示结构化合物为嘧啶类化合物，本发明抗肿瘤活性筛选显示，此类化合物具有较强的抑制淋巴细胞白血病细胞(ramos、raji和namalwa)增殖能力，部分化合物显示出比依鲁替尼(ibrutinib)更加优良的抗btk活性。作为一类结构新颖的分子，本发明中的化合物具有开发成新型高效btk抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病有较大的应用价值。另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有有效剂量的本发明所述通式(ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体。优选地，该药物组合物中含有有效剂量的如上i-1～i-20所示的结构或其药学上可接受的盐，及药用载体。本发明所述化合物由于它们在药物中的可能用途，式(ⅰ)化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱，其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备，包括用无机酸处理游离碱，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或用有机酸处理游离碱、所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidy1acid)，例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，α-羟基酸，例如柠檬酸或酒石酸，氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实施例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolates)、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐(phenylbutrates)、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。本发明的药物组合物通常含有一种本发明化合物。然而，在一些实施方案中，本发明的药物组合物可含有超过一种本发明的化合物。另外，本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。本发明还提供所述嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐，所述药物组合物通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶进而抑制肿瘤增殖的用途。具体地，该用途主要为制备用于治疗伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病的药物中的用途。本发明提供所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备布鲁顿氏酪氨酸激酶抑制剂中的应用。本发明提供所述通式(ⅰ)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或本发明所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。优选地，所述肿瘤选自伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病，进一步优选慢性淋巴细胞白血病。更优选地，所述用途主要通过抑制布鲁顿氏酪氨酸激酶实现的。附图说明图1为本发明实施例ao-eb染色实验结果图。图2为本发明化合物对pbmc的毒性数据结果图。图3为本发明实施例获得的凝胶图像。图4为本发明实施例细胞凋亡结果图。具体实施方式以下结合具体实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。实施例1目标分子的制备薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法(tlc)使用的硅胺板采用的规格是0.15mm-0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。本发明使用的原料主要购自可购买自国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃-30℃。本发明采用的技术方案如下：化合物(ⅰ)的合成路线、试剂及条件:a)丙烯酰氯，nahco3，ch3cn，rt，0.5小时，95％；b)fe-nh4cl，meoh-h2o，2小时，70℃，72％；c)2,4-二氯-5-r-嘧啶，dipea，1,4-二氧六环，60℃，2小时，91％；d)三氟乙酸，中间体5，2-buoh，100℃，12小时，21％至33％。3的合成取1(23.44mmol)和nahco3(4.5g,35.16mmol)于50ml乙腈中，慢慢加入丙烯酰氯(3.8g,23.44mmol)，室温，反应0.5小时后，反应完毕，加入400ml水，析出白色固体，抽滤，烘干，得白色固体2，取白色固体2(19g,68mmol)和氯化铵(7.3g,136mmol)于反应瓶，加入meoh(25ml)和水(25ml)，搅拌下加入铁粉(15g,272mmol)，升温70℃反应2小时，趁热抽滤，水相用乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并乙酸乙酯层，饱和食盐水洗一次，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得黄白色固体3。4的合成取3(23.44mmol)和dipea(4.5g,35.16mmol)于50ml1,4-二氧六环中，慢慢加入2,4-二氯-5-r-嘧啶(3.8g,23.44mmol)，升温60℃，反应2小时后，反应完毕，冷却，加入400ml水，析出黄白色固体，抽滤，烘干，得类白色固体，未纯化直接下一步反应。目标物(ⅰ)的合成取4(23.44mmol)和三氟乙酸(4.5g,35.16mmol)于2-buoh(50ml)中，慢慢加入5(3.44mmol)，升温100℃，反应12小时后，反应完毕，冷却，倒入饱和碳酸氢钠溶液中，析出固体，抽滤，水洗，烘干硅胶柱层析分离，得目标分子(ⅰ)。根据以上方法合成了目标分子，所合成目标分子的理化数据如下：(i-1)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.14(s,1h),9.39(s,1h),9.28(s,1h),8.26(d,j＝8.0hz,1h),8.34(s,1h),7.84(s,1h),7.45–7.40(m,3h),7.31(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.81–6.76(m,2h),6.35(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.24(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.86(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.67(s,2h),4.60–4.53(m,1h),3.69(s,3h),1.48(d,j＝4.0hz,3h)；hrms(esi)forc25h25cln6o5,[m+h]+理论计算:524.3576,实测:524.3506。(i-2)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.20(s,1h),9.47(s,1h),9.29(s,1h),8.16(s,1h),7.87(s,1h),7.47–7.39(m,3h),7.34(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.78–6.66(m,2h),6.45(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.26(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.76(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.67(s,2h),4.36–4.31(m,1h),3.70–3.61(m,2h),3.59(s,3h),2.27–2.06(m,2h),1.98–1.90(m,1h),1.88–1.80(m,1h)；hrms(esi)forc27h27cln6o5,[m+h]+理论计算:550.1081,实测:550.1371。(i-3)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.18(s,1h),9.43(s,1h),9.11(s,1h),8.16(d,j＝18hz,1h),8.0(s,1h),7.76(s,1h),7.49–7.36(m,3h),7.24(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.78–6.52(m,2h),6.35(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.25(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.84(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.84(s,2h),4.60–4.16(m,2h),3.67(s,3h)；hrms(esi)forc23h22cln6o5,[m+h]+理论计算:497.546,实测:497.646。(i-4)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.22(s,1h),9.47(s,1h),9.31(s,1h),8.38(s,1h),8.16(s,1h),8.11(s,1h),7.83(s,1h),7.54–7.49(m,3h),7.45(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.68–6.57(m,2h),6.43(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.23(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.65(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.89(s,2h),4.83–4.71(m,1h),4.60–4.50(m,1h),3.67(s,3h),1.58(d,j＝8.0hz,3h),1.48(d,j＝7.0hz,3h)；hrms(esi)forc28h30cln7o6,[m+h]+理论计算:595.1681,实测:595.1381。(i-5)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.27(s,1h),9.43(s,1h),9.18(s,1h),8.87(s,1h),8.37(s,1h),8.01(s,1h),7.78(s,1h),7.49–7.36(m,3h),7.23(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),7.18–7.08(m,4h),6.80(d,j＝12.0hz,1h),6.78–6.66(m,2h),6.45(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.26(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.76(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.18(m,1h),4.89(s,2h),3.68(s,3h),3.18–2.81(m,2h)；hrms(esi)forc33h29cl2n7o5,[m+h]+理论计算:673.1607,实测:673.1397。(i-6)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.36(s,1h),9.34(s,1h),9.23(s,1h),8.57(s,1h),7.65(s,1h),7.47–7.35(m,3h),7.29(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.78–6.66(m,2h),6.45(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.24(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.63(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.85(s,2h),4.39(m,1h),4.22(m,2h),3.73–3.58(m,2h),3.40(m,1h),2.70–2.49(m,2h),2.20(m,1h),1.50(m,3h)；hrms(esi)forc28h28cl2n6o6,[m+h]+理论计算:614.1447,实测:614.2387。(i-7)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.20(s,1h),9.36(s,1h),9.27(s,1h),8.56(s,1h),8.36(s,1h),7.67(s,1h),7.57–7.43(m,3h),7.30(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.68–6.54(m,2h),6.40(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.20(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.73(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.93(s,2h),4.56(s,1h),4.28–4.08(m,2h),4.16(m,2h),2.50–2.40(m,1h),1.39(m,3h)；hrms(esi)forc26h26cl2n6o6[m+h]+理论计算:588.1291,实测:588.1346。(i-8)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.39(s,1h),9.20(s,1h),9.17(s,1h),8.80(s,1h),8.36(s,1h),8.16(s,1h),7.53(s,1h),7.43–7.29(m,3h),7.16(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.84–6.69(m,2h),6.40(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.15(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.60(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.36(d,j＝10.0hz,2h),4.16–4.10(m,2h),3.30(s,2h),3.19–3.10(m,1h),2.31–2.21(m,2h),1.98–1.70(m,2h),1.64–1.53(m,2h),1.50–1.31(m,3h)；hrms(esi)forc30h32cl2n8o5,[m+h]+理论计算:654.1873,实测:654.1854。(i-9)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.41(s,1h),9.59(s,1h),9.24(s,1h),8.78(s,1h),8.36(s,1h),8.15(s,1h),7.80(s,1h),7.46–7.30(m,3h),7.29(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.68–6.56(m,2h),6.40(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.23(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.56(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.60–4.51(m,1h),4.22–4.10(m,2h),3.39(s,2h),3.19–3.10(m,1h),2.31–2.10(m,2h),1.98–1.70(m,2h),1.65–1.43(m,2h),1.58(d,j＝5.0hz,3h),1.32–1.20(m,3h)；hrms(esi)forc31h34cln8o5,[m+h]+理论计算:652.2325,实测:652.1325。(i-10)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.48(s,1h),9.46(s,1h),9.21(s,1h),8.70(s,1h),8.21(s,1h),8.10(s,1h),7.79(s,1h),7.43–7.30(m,3h),7.26(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.59–6.45(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.21(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.50(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.18(d,j＝8.0hz,2h),4.10–4.01(m,2h),3.50(s,2h),3.36–3.30(m,1h),3.19–3.10(m,1h),2.63–2.38(m,2h),2.50–2.36(m,1h),2.17–1.86(m,2h),1.60(s,3h)；hrms(esi)forc30h32cln8o6,[m+h]+理论计算:654.2117,实测:654.2632。(i-11)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.38(s,1h),9.45(s,1h),9.26(s,1h),8.57(s,1h),8.20(s,1h),8.08(s,1h),7.69(s,1h),7.53–7.36(m,3h),7.25(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.50–6.43(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.11(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.65(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.61–4,51(m,1h),4.26–4.05(m,2h),4.12–4.02(m,2h),3.65–3.50(m,1h),3.39(s,2h),3.29–3.10(m,1h),2.33–2.28(m,2h),1.98–1.71(m,2h),1.69–1.59(m,2h),1.60(s,3h)；hrms(esi)forc31h34clfn8o6,[m+h]+理论计算:668.2274,实测:668.2168。(i-12)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.49(s,1h),9.49(s,1h),9.37(s,1h),8.55(s,1h),8.24(s,1h),7.97(s,1h),7.53–7.36(m,3h),7.25(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.50–6.43(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.11(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.65(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.83(s,2h),4.69–4.60(m,1h),3.67(s,3h),1.58(d,j＝10.0hz,3h)；hrms(esi)forc25h24clfn6o5,[m+h]+理论计算:542.1481,实测:542.1283。(i-13)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.58(s,1h),9.31(s,1h),9.27(s,1h),8.50(s,1h),8.32(s,1h),7.86(s,1h),7.58–7.44(m,3h),7.29(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.56–6.33(m,2h),6.28(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.18(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.85(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.89(s,2h),4.16–4.06(d,j＝10.0hz,2h),3.69(s,3h),2.65(s,3h)；hrms(esi)forc26h25f3n6o5,[m+h]+理论计算:558.1839,实测:558.1743。(i-14)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.38(s,1h),9.45(s,1h),8.57(s,1h),8.20(s,1h),7.69(s,1h),7.53–7.36(m,3h),7.25(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.50–6.43(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.11(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.65(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.89(s,2h),4.36–4.29(m,1h),3.60–3.51(m,2h),2.47–2.16(m,2h),2.18–1.98(m,2h),3.69(s,3h)；hrms(esi)forc28h26f4n6o5,[m+h]+理论计算:602.1905,实测:602.1875。(i-15)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.38(s,1h),9.76(s,1h),9.45(s,1h),9.08(s,1h),8.57(s,1h),8.20(s,1h),7.69(s,1h),7.53–7.36(m,3h),7.28–7.09(m,4h),7.25(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.80(m,1h),6.50–6.43(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.11(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.65(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.91(m,1h),4.86(s,2h),3.76(s,3h),3.16–2.87(d,j＝2.4hz,2h),2.45(s,3h)；hrms(esi)forc34h32fn7o5,[m+h]+理论计算:637.2449,实测:637.2345。(i-16)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.28(s,1h),9.34(s,1h),9.20(s,1h),8.68(s,1h),7.59(s,1h),7.46–7.32(m,3h),7.27(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.85–6.76(m,2h),6.40(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.36(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.61(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.80(s,2h),4.54(m,1h),4.21(m,2h),3.78–3.50(m,2h),3.41(m,1h),2.78–2.45(m,2h),2.29(m,1h),1.59(m,3h)；hrms(esi)forc28h28f2n6o6,[m+h]+理论计算:582.2038,实测:582.2435。(i-17)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.28(s,1h),9.34(s,1h),9.27(s,1h),8.78(s,1h),8.49(s,1h),8.16(d,1h),8.0(s,1h),7.94(d,1h),7.49–7.36(m,3h),7.24(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.78–6.52(m,2h),6.35(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.25(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.84(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.16(d,2h),4.12–4.02(m,2h),3.30(s,2h),3.19–3.09(m,1h),2.30–2.20(m,2h),1.95–1.72(m,2h),1.65–1.55(m,2h),1.43–1.30(m,3h)；hrms(esi)forc31h33f3n8o5,[m+h]+理论计算:654.2526,实测:654.2532。(i-18)1hnmr(400mhz,dmso-d6):10.46(s,1h),9.56(s,1h),9.18(s,1h),8.70(s,1h),8.53(s,1h),8.10(s,1h),7.80(s,1h),7.48–7.35(m,3h),7.19(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.78–6.50(m,2h),6.43(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.21(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.43(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.60–4.53(m,1h),4.22–4.11(m,2h),3.39(s,2h),3.29–3.08(m,1h),2.51–2.39(m,2h),1.97–1.77(m,2h),1.65–1.43(m,2h),1.68(d,j＝5.0hz,3h),1.42–1.30(m,3h)；hrms(esi)forc32h34clf3n9o5,[m+h]+理论计算:702.2293,实测:702.1412。(i-19)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.22(s,1h),9.24(s,1h),8.76(s,1h),8.39(s,1h),8.24(d,1h),8.0(s,1h),7.89(d,1h),7.47–7.32(m,3h),7.20(dd,j＝16.0,8.0hz,2h),6.76–6.52(m,2h),6.30(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.24(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.75(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.36(d,j＝10.0hz,1h),4.16(d,j＝10.0hz,2h),4.12–4.02(m,2h),3.32(m,1h),3.30(s,2h),3.28–3.18(m,1h),2.53–2.28(m,2h),2.11–1.88(m,2h),1.50(m,3h)；hrms(esi)forc30h33fn8o6,[m+h]+理论计算:620.2507,实测:620.2408。(i-20)1hnmr(400mhz,dmso-d6):δ10.28(s,1h),9.30(s,1h),9.11(s,1h),8.76(s,1h),8.35(s,1h),8.11(s,1h),7.89(s,1h),7.36–7.20(m,3h),7.16(dd,j＝16.0,8.0hz,1h),6.69–6.40(m,2h),6.35(dd,j＝16.0,12.0hz,1h),6.28(dd,j＝16.0,4.0hz,1h),5.56(dd,j＝8.0,4.0hz,1h),4.38(d,j＝8.0hz,2h),4.18–4.08(m,2h),3.52(s,2h),3.56–3.41(m,1h),3.19–3.10(m,1h),2.63–2.38(m,2h),2.50–2.36(m,1h),2.17–1.86(m,2h),1.60(s,3h)；hrms(esi)forc31h34clfn8o6,[m+h]+理论计算:668.2274,实测:668.2365。目标分子成盐的方法无机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10ml无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加无机酸(1mmol)的5ml无水甲醇溶液，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除甲醇，即得目标分子的无机酸盐。有机酸盐的制备方法：取目标分子(1mmol)溶于10ml无水甲醇中，冰浴下，慢慢滴加有机酸(1mmol)的5ml干燥乙醚，滴加完毕，于此温度下搅拌30分钟，然后常温蒸除溶剂，即得目标分子的有机酸盐。两个目标分子混合物的制备取等摩尔量(1mmol)的上述两个目标分子于无水甲醇中(5ml)，室温搅拌10分钟，常温蒸除溶剂，即得目标分子的混合物。实施例2目标分子生物活性评价1、体外对受体酪氨酸激酶抑制活性测试方法(1)制备激酶检测缓冲液①在室温融解激酶检测缓冲液(kinasedetectionbuffer)，观察是否有沉淀。②如果出现沉淀，就在37℃孵育(kinasedetectionbuffer)15分钟并经常摇动，溶解沉淀。或者，小心吸走上清，去除沉淀。(2)制备激酶检测试剂①使用前在室温平衡激酶检测缓冲液(kinasedetectionbuffe)和(kinasedetectionsubstrate)。②将激酶检测缓冲液(kinasedetectionbuffer)全部倒进装有激酶检测底物(kinasedetectionsubstrate)的棕色瓶中，使冻干粉底物溶解，这样就制成了激酶检测试剂。③轻轻震荡、涡旋或颠倒混匀，成为均质溶液，底物应在1分钟内溶解。④激酶检测试剂配好后应立即使用，或分装存于-20℃，我们认为配好的试剂经过几次冻融后循环信号活性都没有损失。(3)制作atp转化成adp的标准曲线①用1×激酶反应缓冲液(kinasereactionbuffer)稀释试剂盒提供的ultrapureatp和adp，制成900μl50μmatp和500μl50μmadp。②将上一步配好的50μmatp和50μmadp溶液按表1所示在384孔板a1-a12中混合，模拟每个转化百分比的atp和adp的浓度，混合好。表1.制备50μm系列atp+adp标准品③每孔加入5μl的adp-glotm试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。④每孔加入10μl激酶检测试剂(kinasedetectionreagent)将adp转化成atp，并引进萤光素酶和萤光素来检测atp。⑤在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。⑥绘制atp转化成adp的标准曲线。(4)确定激酶抑制物的ic50值①按照promega试剂盒说明书配制1×激酶反应缓冲液(kinasereactionbuffer)，2.5×50ng/μl激酶和2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。②在无酶对照孔中加入3μl1×激酶反应缓冲液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在阴性对照孔中加入1μl1×激酶反应缓冲液(kinasereactionbuffer)，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。在测试孔中加入1μl5×待测药物，2μl2.5×50ng/μl激酶，2μl2.5×0.5μg/μl底物和125μmatp。③混合好平板，孵育60分钟。④每孔加入5μl的adp-glotm试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。⑤每孔加入10μl激酶检测试剂(kinasedetectionreagent)将adp转化成atp，并引进萤光素酶和萤光素来检测atp。在室温孵育30-60分钟，用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。⑥结果分析，结果是表2所示。2、抑制btk高表达细胞生长实验(cck-8检测法)(1)细胞类型及选择：ramos细胞(人burkitt’s淋巴瘤细胞、btk激酶高表达)、raji细胞(人burkitt’s淋巴瘤细胞、btk激酶高表达)、namalwa细胞(人burkitt’s淋巴瘤细胞、btk激酶高表达)。(2)细胞接种：收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔5x103个细胞，每孔体积100μl接种到96孔板，每组设3个复孔(边缘孔用无菌pbs填充)；(3)细胞培养：细胞接种后，对照组用10％fbsrpmi-1640培养，实验组分别用10μl不同浓度梯度的依鲁替尼(ibrutinib)(1.25-40μmol/l)、各不同药物(1.25-40μmol/l)干预，37℃，5％co2培养箱中继续培养(按实验要求分别培养不同时间)；(4)呈色：三组细胞分别于培养72h后加入10μlcck-8溶液(5mg/ml)，4h后终止培养，于摇床上低速振荡10min，使结晶充分溶解；(5)比色：在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(od值)，选择570nm波长，以无细胞的即rpml-1640培养液空白孔调零，测各孔的吸光度值。实验重复三次；(6)记录结果：细胞生长抑制率＝(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100％，细胞增殖率＝(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100；(7)绘制细胞生长曲线：以时间为横坐标，抑制率/增殖率为纵坐标绘制细胞生长曲线。(8)在graphpad软件中的graphpadprism作图软件中针对抑制剂浓度做图，以便由log[抑制剂]相对于反应，可变斜率模型估算出ic50。测试结果如表2所示，表2显示所获得的化合物在抑制btk酪氨酸激酶和抗肿瘤细胞增殖中的活性效果。表2a:ic50：半数有效抑制浓度.b:ramos,raji,namalwa为典型b-淋巴细胞白血病细胞，btk激酶高度表达.3、吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色(ao/eb)(1)细胞培养：常规扩大培养namalwa细胞，取对数生长期的细胞以2x105cells/孔的密度接种于6孔板中；(2)药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理贴壁良好的细胞48小时；具体药物及使用浓度如下表3：表3(3)ao-eb染色：弃去培养液，用pbs洗两次，每孔以20μlao-eb溶液(1μg/mlao+1μg/mlebinpbs)染色，倒置荧光显微镜下观察细胞各期凋亡、死亡等变化，拍照，结果如图1所示。4、细胞毒性试验(pbmc检测法)外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)包含淋巴细胞、单核细胞(monocyte)，树突状细胞和其他少量细胞(造血干细胞等)。对其进行毒性试验可以证明本发明的药物是否对正常免疫细胞具有杀伤力。目前国内外分离pbmc的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法，实验步骤如下：(1)采血并稀释：静脉取血2ml，加入含acd抗凝溶液的试管中，混匀，使血液抗凝。用pbs将抗凝血稀释一倍；(2)加样：吸取2ml淋巴细胞分层液(天津tbd)置于刻度离心管中，将离心管倾斜45°角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰；(3)离心：在18°～20°下，用水平离心机以2000r/min离心20min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；(4)回收：用毛细吸管轻轻插入浑浊带，沿管壁轻轻吸出此细胞层，移入另一只离心管中。既要吸取所有单个核细胞，又要避免吸入过多的分层液和血浆，以免混入其他细胞成分；(5)洗涤：用pbs洗涤细胞三次。第一次用2000r/min，10min；第2～3次1500r/min，10min，可去掉大多数混杂的血小板；(6)将沉淀细胞悬于培养基中备用；(7)计数铺板：调整细胞悬液的浓度，以每孔2.5×105个细胞，每孔体积400μl接种在24孔板，每组设两个复孔；(8)细胞培养：细胞接种后，对照组用10％fbsrpmi-1640培养，实验组分别用50μl不同浓度梯度的依鲁替尼(ibrutinib)(5-20μmol/l)，活性药物(5-20μmol/l)干预，37℃，5％co2培养箱中继续培养(按实验要求分别培养不同时间)；(9)染色：培养24h后加入20μl的1μg/μlao(吖啶橙)，20μl的1μg/μlpi(碘化丙啶)染色5min，倒置荧光显微镜下观察并拍照；测试结果如图2所示，图2是化合物对pbmc的毒性数据。5、蛋白质印迹法(westernblotting)5.1细胞总蛋白提取1、na细胞扩大培养后，分别给予如下表4常规药物处理，处理48小时：表42、48小时后pbs洗细胞两次，加入150ul蛋白裂解液，涡旋仪上涡旋8-10次，冰上裂解35-40min；3、裂解完成后，于4℃下12000rpm离心15min；4、测定蛋白质浓度：采用碧云天bradford蛋白浓度测定试剂盒；5、将离心后的上清加入上样缓冲液，100℃5min，然后放于-80℃保存、备用。5.2细胞总蛋白定量(bradford法)1、制作标准曲线(1)从-20℃取出1mg/mlbsa，室温融化后，备用。(2)取6个1.5ml离心管，分别标记为0μg，2.5μg，5.0μg，10.0μg，20.0μg，40.0μg。(3)按下表5在各管中加入各种试剂。表5管别0μg2.5μg5.0μg10.0μg20.0μg40.0μg1mg/mlbsa－2.5μl5.0μl10.0μl20.0μl40.0μl0.15mol/lnacl100μl97.5μl95.0μl90.0μl80.0μl60.0μl考马斯亮蓝溶液g2501ml1ml1ml1ml1ml1ml(4)混匀后，室温放置2min。在96孔板中加入以上每组样品，每孔200ul，每个浓度设三个复孔，于酶标仪595nm测定od值，制备标准曲线。2、检测样品蛋白含量(1)取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。室温放置30min后即可用于测蛋白。(2)取一管考马斯亮蓝加0.15mol/lnacl溶液100μl，混匀放置2分钟可做为空白样品，同上法测定od值，实验重复三次，取均值。(3)取一管考马斯亮蓝加95μl0.15mol/lnacl溶液和5μl待测蛋白样品，混匀后静置2min，同上法测定od值，实验重复三次，取均值。(4)根据标准曲线和样本吸光度换算得到待测样品蛋白质浓度。5.3十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds－page)测定完蛋白含量后，计算含100μg蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×sds上样缓冲液至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品。)上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性，然后置于冰上，备用。1、灌胶：在灌胶之前首先清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸取洗涤剂轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水反复冲洗干净至不挂水，最后用蒸馏水冲洗干净后站立晾干。(1)玻璃板对齐后放入制胶架中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。)(2)配制10％分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml移液枪吸取5ml胶沿玻璃以一定速度放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后在胶面上加一层水，液封后的胶凝速度大大提高。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，以避免胶中出现气泡。加水液封时速度要慢，否则分离胶会被冲散、变形。)(3)当水和胶之间出现折射线时，提示分离胶已凝。再等3min使胶充分凝固，倾去胶上层液封水，并用滤纸将水小心吸干，注意不要接触胶面。(4)配制4％浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免产生气泡。插梳子时要尽量使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔出。(5)用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。(小玻璃面向内，大玻璃面向外。)2、加样(1)向电泳槽中加入足够的电泳缓冲液，准备上样。(电泳液至少要浸没内侧小玻璃上沿。)(2)取出预处理好的蛋白样品，用微量进样器贴壁吸取样品，注意不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。)3、电泳(1)插好电源，注意接头电极方向。(2)设置恒压，60v(6v/cm)，当指示染料溴酚蓝前沿进入分离胶后，时间约30min，将电压提高到100－120v(15v/cm)，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，关闭电源，终止电泳。5.4转膜1、准备工作(1)转一张膜需准备6张7.0-8.3cm的滤纸和1张7.3-8.6cm的pvdf膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，避免手部蛋白污染膜。将切好的pvdf膜做好标记，置于水中浸泡2小时。(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。(2)将转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻璃棒、滤纸和浸湿的膜放入加有转移缓冲液的搪瓷盘里。(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻璃棒擀去其中的气泡。2、取胶(1)于玻璃板两个边上轻轻将其撬开，小心取下玻璃板。将浓缩胶轻轻切去(浓缩胶影响操作)，避免把分离胶刮破，在分离胶的左上角切一个斜角作为标记。(2)将分离胶浸于转移缓冲液中进行平衡。3、转膜(1)将平衡后的分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除去气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。(转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验空间保持空气流通。)(2)将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，可以在槽的一边放置冰块降温(100v/100ma)。(3)转膜完毕后将膜用1×丽春红染液染色5min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可观察膜上的蛋白。将膜晾干备用。5.5免疫反应1、封闭(1)配制封闭液(5％脱脂牛奶intbst)。(2)将膜用tbst从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上缓慢摇动，室温封闭2小时。2、一抗结合(1)配制一抗稀释液：5％bsaintbst，调整ph为7.4，以保证抗原抗体反应于适宜的ph条件下进行)。(2)把膜从封闭液里取出，用tbst冲洗一遍后，浸没于含一抗(如下表6)的杂交盒里，置于4℃摇床上缓慢摇动，孵育过夜。磷酸化抗体至少孵育12小时。其他抗体也可室温孵育2-3h。表6一抗名称来源稀释倍数二抗btk一抗bioworldtechnology1:3001:6000p-btk一抗bioworldtechnology1:3001:60003、二抗结合(1)一抗孵育结束后，回收一抗，并于-20℃保存。将pvdf膜用tbst在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。(2)根据一抗的来源选择相应的二抗，将二抗用封闭液进行一定比例的稀释(1:2000-1:5000)，室温孵育1-2h。4、化学发光，显影，定影(1)二抗孵育结束后，可进行二抗的回收再利用，使用两次后弃去。膜用tbst在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。(2)准备好曝光盒、显色液及保鲜膜等。(3)将ecl-a和ecl-b两种试剂在保鲜膜上进行等体积混合；1min后，将pvdf膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去除残余液体，包裹好，放入x-光片夹中。(4)在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出x-光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开x-光片夹，把x-光片放在膜上，一旦放上，便不能再移动，关闭x-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以取得最佳效果；曝光完成后，打开x-光片夹，取出x-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为1-2min(20-25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；显影结束后，马上将x-光片浸入定影液中，定影时间一般为5-10min，以胶片呈透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。(注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿取胶片的一角，手指甲不要划伤胶片，否则将会对结果产生影响。)5、凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象分析软件(quantityone)分析目标条带的分子量和光密度值，所得结果如图3所示。6、细胞凋亡实验(1)细胞培养：常规扩大培养namalwa细胞，取对数生长期的细胞以2x105cells/孔的密度接种于6孔板中；(2)药物处理：于次日用不同浓度的药物(抑制剂)处理贴壁良好的细胞48小时，具体药物及使用浓度如表7；表7(3)细胞收集：将药物处理后的细胞用不含edta的胰酶消化收集，pbs洗涤细胞两次，每一处理组收集细胞总数不少于1×105个；(4)凋亡检测：于固定好的细胞中加入5ulannexinv-fitc混匀后，再加入5ulpi；避光、室温反应10min；用流式细胞仪检测(ex＝488nm；em＝530nm)细胞凋亡情况，所得结果如图4所示。以上生物活性结果表明，本发明中的分子对btk激酶有较强的抑制效果，大部分化合物达到纳摩尔水平的活性级别，且有将近一半的化合物的有效抑制浓度ic50值小于10nmol，与依鲁替尼(ibrutinib)相当。抗细胞增殖活性结果揭示，大部分化合物对淋巴细胞白血病细胞(ramos、raji、namalwa)有非常有效的抑制作用，其中化合物i-2、i-5、i-7、i-8、i-10、i-12、i-14、i-15、i-16还显示出了优于依鲁替尼(ibrutinib)的活性，特别是i-5、i-7、i-8、i-14、i-16的效果是本领域技术人员无法预料的。ao/eb荧光双染法结果表明i-2作用于淋巴细胞白血病细胞namalwa细胞，可引起细胞凋亡的形态学改变。流式分析结果显示i-2能使淋巴细胞白血病细胞namalwa细胞的凋亡率明显增加，呈剂量依赖性，其作用优于依鲁替尼(ibrutinib)。同时图2显示，化合物i-2的细胞毒性也比依鲁替尼(ibrutinib)显著减小，在保证药物活性的同时减轻药物的毒性，具有潜在的药用价值。蛋白质印迹实验表明，i-2能够显著抑制btk信号通路中相关蛋白的表达，随着给药浓度的依次增大，p-btk表达水平下调，呈现出剂量依赖性。预示此类分子具有开发成新型高效btk抑制剂的潜力，对治疗相关的肿瘤疾病尤其是伯基特氏淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病有较大的应用价值。以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12