本发明涉及食用菌特别是银耳菌种中银耳和香灰菌定量配比检测领域，特别是涉及一种基于高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法及其应用。
背景技术：
中国是食用菌生产大国，年产量约占世界的3/4，在我国农业生产中食用菌已位居第五大产业，仅次于粮食、蔬菜、果树、油料。银耳又称白木耳，雪耳，在真菌中隶属于担子菌门(basidiaomycota)、伞菌亚门(agaricomycotina)、银耳纲(tremellomycetes)、银耳目(tremellales)、银耳科(tremellaceae)、银耳属(tremella)，是我国传统食药兼用真菌，它不仅是我国医学宝库中久负盛名的良药，也是滋补佳品和筵席佳肴。我国是银耳人工栽培的发源地，也是世界银耳生产和出口最多的国家，银耳年总产量已接近40万吨。其中以袋料栽培为主要模式的福建省是银耳生产产量最大的省份，其始终占据全国银耳总产量的90％以上。
与大多数生产栽培的食用菌种类不同，银耳有其非常独特的生活史，它必须在伴生真菌香灰菌的协同作用下才能完成其生活史。银耳自身没有分解木质纤维素与淀粉基质的能力，不能单独在木质纤维素上生长，只有与香灰菌进行共生培养时才能正常生长发育并且形成子实体。香灰菌在银耳的培养过程中充当了伴生菌的角色，分泌基质降解酶对栽培料基质进行分解，为银耳的生长发育提供营养。因此在生产上银耳菌种的制备过程中银耳和香灰菌的比例是非常关键的，直接影响后期银耳子实体生长发育及其商业价值。然而在实际的生产过程中，这一关键步骤经常被经验所代替，菌种制备者根据银耳菌丝生长较慢，香灰菌丝生长快的这一特点利用经验观察的手段来进行银耳和香灰菌的配制，从而使这一过程充满了不确定性和不可控性。随着生产的持续开展，银耳菌种的质量就无法保证，在实际生产中往往出现出耳率低或不出耳等现象。并且由于不能定量地配比银耳和香灰菌丝，给菌种的选育特别是对于新分离的野生种带来很大的障碍。因此，对银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量检测是生产中最为关键的决定性一环，在定量的基础上，提出在实际生产中可以运用的菌种选育方法，以突破食用菌菌种生产中的技术壁垒。
高通量测序技术具有高效、快速、准确、经济的特点。目前，此项技术已经广泛应用于环境微生物、人类和植物病原微生物的检测等方面。但是在食用菌菌种的检测方面，尚没有利用高通量测序技术的相关研究和报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法及其应用。
第一方面，本发明要求保护一种检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法。
本发明所提供的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法，是采用高通量测序的方法检测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比。
进一步地，所述方法可包括如下步骤：采用真菌its2区引物对待测银耳菌种的基因组进行pcr扩增建库，高通量测序，然后将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行otu聚类分析，对比真菌its序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的otu信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。
更进一步地，所述方法具体可包括如下步骤：
(1)提取待测银耳菌种的基因组dna；
(2)对提取的基因组dna进行质量检测；
(3)采用真菌its2区引物对基因组进行pcr扩增建库；
(4)通过miseq平台进行高通量测序；
(5)将高通量测序所得结果数据过滤去杂后根据97％以上相似性进行otu聚类分析，对比真菌its序列数据库，得到银耳和香灰菌对应的otu信息，进而实现对所述待测银耳菌种中银耳和香灰菌的配比的定量分析。
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，具体是采用月桂酸钠法提取所述待测银耳菌种的基因组dna的。
在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，采用的所述真菌its2区引物中的特异性部分的序列为seqidno.1和seqidno.2。进一步地，所采用的引物是带有barcode的特异性引物。
在本发明的一个实施例中，步骤(5)中，具体是按照如下标准对所述高通量测序所得结果数据进行过滤去杂的：a1)过滤读长(read)尾部质量值20以下的碱基，设置20bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后100bp以下的读长(read)；a2)根据双末端测序读长(pereads)之间的重叠(overlap)关系，将成对读长(reads)拼接成一条序列，最小重叠(overlap)长度为10bp；a3)提取非重复序列，并去除没有重复的单序列。
其中，双末端测序读长(pereads)就是paired-endreads。reads(读长)是高通量测序中一个反应获得的测序序列。在测序过程中，一条dna分子的两端都可以测序。先测其中的一端，获得一个reads，然后再转到另一端测序，获得另外一个reads。得到的这两个reads就是pereads。
在本发明的一个实施例中，步骤(5)中，具体是利用usearch方法进行所述otu聚类分析的。当然也可以采用usearch方法外的其他方法进行所述otu聚类分析。
在本发明的一个实施例中，步骤(5)中，所述真菌its序列数据库具体为ncbi数据库和/或unite数据库。
第二方面，本发明要求保护所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)在评估银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比对银耳子实体的形成和/或发育的影响中的应用。
第三方面，本发明要求保护所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)在指导银耳菌种配制中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种指导银耳菌种配制的方法。
本发明所提供的指导银耳菌种配制的方法，具体可包括前文所述方法(即前文所述的检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法)中的全部步骤和如下步骤：结合银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比进行银耳子实体发育试验，试验过程中观察银耳菌种中银耳和香灰菌不同配比下银耳子实体的形成和/或发育情况，从而为生产中的银耳菌种配制提供参考标准。
第五方面，本发明还要求保护一种具体的配制银耳菌种的方法。
本发明所提供的配制银耳菌种的方法，具体包括如下步骤：将银耳菌种配制成其中银耳菌丝含量高于1倍香灰菌菌丝含量且低于2倍香灰菌菌丝含量。更加具体地，是将银耳菌种配制成其中银耳菌丝含量为香灰菌菌丝含量的1.25倍。
本发明的检测方法，利用高通量测序技术，对银耳菌种的基因组dna进行测序，并通过生物信息学分析对银耳菌种中银耳和香灰菌的配比进行分析，结合不同配比下银耳菌种子实体生长情况，定量评估银耳和香灰菌不同配比对子实体形成的影响，为银耳生产中的菌种的制备提供可靠的参考标准。特别适用于各食用菌服务和研究单位，以突破或制定出相应的技术壁垒，保障食用菌生产的安全性和稳定性。
附图说明
图1为不同银耳/香灰菌配比条件下银耳子实体鲜重。标注不同小写字母表示在p<0.05水平上差异显著。
图2为不同银耳/香灰菌配比条件下银耳子实体干重。标注不同小写字母表示在p<0.05水平上差异显著。
图3为不同银耳/香灰菌配比条件下废菌包的重量。标注不同小写字母表示在p<0.05水平上差异显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基于高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法及其应用
本实施例以古田主栽银耳黄色品种tr21为研究对象，分别挑取22℃，24℃，28℃培养条件下的菌种，每个温度条件下做3个重复。样品来源为2017年12月福建古田科峰食用菌研究所。
一、采用月桂酸钠法对银耳菌种的基因组dna提取
(1)称取菌种瓶中混合有木屑培养料的银耳菌种样品2-3g置于研钵中，加入适量液氮，迅速研磨均匀至粉末级。
(2)将研磨好的粉末移入灭菌后的1.5ml离心管中，立即加入750μl的月桂酸钠抽提缓冲液，反复缓慢的摇匀，约10min；
其中，所述月桂酸钠抽提缓冲液的配方：tris-hcl(ph8.0)100mmol/l；nacl100mmol/l；edta(ph8.0)20mmol/l；月桂酸钠1％。配法：准确称取nacl5.844g，月桂酸钠10g置于1000ml烧杯中，加入100mltris-hcl(1m)以及40mledta(0.5m)、800mlddh2o，用盐酸调节ph至8.0，定容至1000ml，灭菌后室温保存。
(3)用移液管向1.5ml离心管中加入等体积(约700μl)的酚:氯仿:异戊醇(体积比25:24:1)，反复缓慢的摇匀。
(4)13000rpm，4℃离心20min后取出，小心吸取上清液约700μl于新灭菌的1.5ml离心管中。
(5)加入rnaase(20mg/ml)5μl，37℃，30min，重复步骤(3)，加入等体积(约705μl)的氯仿:异戊醇(体积比24:1，)，反复缓慢的摇匀，13000rpm，4℃离心20min后取出，小心吸取上清液约700μl于新灭菌的1.5ml离心管中。
(6)向上述离心管中加入700μl异丙醇，上下缓慢颠倒数次，有白色絮状沉淀析出，颠倒时注意往一个方向，防止沉淀散开，不利于后续实验，-20℃放置1h。
(7)13000rpm，4℃离心20min，丢弃上清。
(8)加入100μl70％乙醇(体积分数)，反复轻轻震荡洗涤，4℃，13000rpm，高速离心15min，弃上清，重复此步骤两次。
(9)将得到的白色沉淀再次4℃，12000rpm短暂离心数秒，用移液器吸干残留乙醇。
(10)白色沉淀置于通风橱内过夜，使残存的70％乙醇全部挥发干净。
(11)待白色沉淀变透明后，向1.5ml离心管中加入50μl灭菌水中，室温放置1-2个小时，期间轻微弹匀，使dna充分溶解。
(12)采用nanodrop2000荧光分光光度计对基因组dna进行质量和浓度检测。
二、真菌its2区pcr扩增
根据nanodrop2000测得的dna浓度，取适量体积、总量约30ng的基因组dna样品进行pcr扩增。选用的引物为真菌its2区特异性引物fits7(5’-gtgartcatcgaatctttg-3’，即seqidno.1)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，即seqidno.2)。本发明使用的引物是带有barcode的特异性引物。
pcr反应体系为：dna样品30ng；fits7引物(5μm)1μl；its4引物(5μm)1μl；bsa(2ng/μl)3μl；2×taqpcrmastermix12.5μl；ddh2o补至25μl。
pcr扩增程序为：95℃5min；35×(95℃45s，58℃50s，72℃45s)；72℃10min。
每个样本重复三次pcr，将同一样本的pcr产物混合后用2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用axyprepdna凝胶回收试剂盒(axygen公司)切胶回收pcr产物，tris_hcl洗脱后用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
三、pcr产物的荧光定量
参照电泳初步定量结果，使用caliperlabchip仪器和荧光定量试剂htdna1kreagentkit对pcr产物进行定量，之后按照每个样本的测序量为2万条要求，进行相应比例的混合。
四、miseq文库构建和高通量测序
miseq文库的构建及高通量测序由北京奥维森基因科技有限公司illuminamiseq(pe300)平台进行，得到测序的数据。
五、测序结果的生物信息学分析流程
(1)过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置20bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后100bp以下的read；
(2)根据pereads之间的overlap关系，将成对reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10bp；
(3)将fastq文件改名；
(4)将fastq文件转化为fasta文件；
(5)合并所有样本的fasta序列；
(6)对优化序列(即根据步骤(1)-(5)得到的序列)提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量；
(7)去除没有重复的单序列；
(8)利用usearch方法按照97％相似性对非重复(不含单序列)进行otu聚类；
(9)去除嵌合体(即不同位置的序列连接到一起后形成嵌合体)；
(10)将所有优化序列(即根据步骤(1)-(9)得到的序列)map至otu聚类后不同类别的代表序列，选出与otu代表序列相似性在97％以上的序列，生成otu表格；
(11)将序列相似性97％以上的不同otu类别的代表序列和ncbi和unite数据库进行比对，从而得到银耳和香灰菌对应的otu信息，进而实现对银耳菌种中银耳和香灰菌进行定量分析。
六、结果与分析
1、银耳菌种中银耳/香灰菌配比的定量检测
银耳和香灰菌各自的最适生长温度范围不同，因此利用温度控制银耳栽培种中银耳和香灰菌的比例。分别选取22℃，24℃，28℃温度条件下对银耳栽培种进行培养7-8天，每个温度条件下做3个重复，共计9个样品。对这9个菌种样品的基因组dna进行了高通量测序，共计获得342322条序列，平均每个样品获得38035条序列。将每个配比的3个重复样品的测序结果和otu单元进行整合，分别获得127028、100603、114691条序列。3个不同配比的样品处理中，银耳菌种中银耳-香灰菌复合菌种的含量分别为95.98％，96.23％和95.43％，占据了绝对的优势。其中22℃，24℃，28℃温度银耳菌种中银耳与香灰菌的比例(两者菌丝含量的比值)分别为0.8，1.25和2.35。
2、不同银耳/香灰菌配比的菌种子实体产量的测定
对步骤1测定的3个不同银耳/香灰菌配比(两者菌丝含量的比值)处理的菌种进行出耳实验(第1种配比方案：银耳/香灰菌的比例为0.8；第2种配比方案：银耳/香灰菌的比例为1.25；第3种配比方案：银耳/香灰菌的比例为2.35)，经30天左右测定其子实体的鲜重、干重和废菌包的重量。结果可以看出，在第2种配比方案(即银耳/香灰菌比例为1.25)银耳子实体的鲜重和干重最高，废菌包的重量最小，说明这种配比模式银耳菌和香灰菌的比例最为合适，菌包中的重量得到充分的利用，从而产生的子实体重量最高。对子实体鲜重、干重和废菌包重量进行单因素方差分析(anova)显示，第2种配比模式银耳子实体鲜重和干重均显著高于第1、3种配比方案，而废菌包重量均显著低于第1、3种配比方案(图1、图2和图3)。这说明银耳菌丝的含量低于香灰菌的含量(如第1种配比模式)或者银耳菌丝含量高于香灰菌丝含量的2倍以上(如第3种配比方案)的银耳菌种产生的子实体鲜重都显著低于第2种配比方案。第2种配比模式废菌包的重量最低，与此种配比模式鲜重最高相对应，表明此种配比菌包利用率最高。由此得出在实际生产中，银耳菌和香灰菌丝的配比一定要在合适的范围内(即将银耳菌种配制成其中银耳菌丝含量高于1倍香灰菌菌丝含量且低于2倍香灰菌菌丝含量)其子实体产量才能够最高。
<110>中国科学院微生物研究所；福建农林大学
<120>高通量测序技术检测银耳菌种中银耳和香灰菌配比的方法
<130>gncln180820
<160>2
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<222>(5)..(5)
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gtgartcatcgaatctttg19
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tcctccgcttattgatatgc20