本发明属于抗生素耐药基因检测技术领域，具体涉及一种用于检测细菌mcr-1基因的引物组合物及应用。
背景技术：
自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，细菌抗药问题日益凸显。耐药性细菌使得抗生素药物效减弱、甚至失效。多粘菌素(polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(a,b,c,d,e)。临床常用的是多粘菌素(polymyxinb)和多粘菌素e(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线。
一些动物和动物性产品，环境中采集的大肠杆菌样本内存在一种新型的抗生素耐药基因mcr-1基因；另外，在住院患者的大肠杆菌和肺炎克氏杆菌样本中也发现了mcr-1基因。mcr-1基因以质粒为载体存在于细菌中，能够以水平基因转移方式在不同菌株间进行遗传物质的交换。这种转移模式打破亲缘关系的界限，能够在不同细菌之间传播，且速度快。mcr-1基因的发现，预示着抗生素最后一道防线——多粘菌素已然遭到威胁。
对于mcr-1基因的检测对于监控耐药细菌爆发，指导患者感染用药具有重要作用，本发明提供一种mcr-1基因检测的环介导等温扩增(lamp)方法以及试剂盒产品。检测时间短，不超过3小时，为快速、准确诊断细菌mcr-1基因检测和耐药性预警提供依据。
技术实现要素：
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种用于检测细菌mcr-1基因的引物组合物及其应用，可以检测mcr-1耐药基因。
为了解决上述技术问题，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种用于检测细菌mcr-1基因的引物组合物，包括以下引物：外引物f3和b3，内引物fip和bip，环引物lf和lb，其中各引物的dna序列如下所示：
f3：tccgtttgttcttgtggcg
b3：caggctttagcacatagcga
fip：tccgcgatgggataggtttgggtgttgccgttttcttgacc
bip：aatctcggctttgtgctgacgacgatgataacagcgtggtga
lf：aaaaggtaagattggcggtcg
lb：cgctgtcgtgctctttgg
所述的引物还包括将f3、b3、fip、bip、lf和lb引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的dna分子。
本发明提供了上述引物组合物在环介导等温扩增方法中用以检测细菌mcr-1基因的应用。
所述的引物组合物在环介导等温扩增(lamp)方法中，引物组合物f3、b3、fip、bip、lf和lb的摩尔浓度比为1：1：4：4：2：2。
所述的环介导等温扩增反应条件为60-65℃恒温70min。
本发明还提供了上述组合物在制备检测细菌mcr-1基因试剂盒中的应用。所属试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
一种用于耐药基因mcr-1检测的试剂盒，所述的试剂盒通过环介导等温扩增方法进行检测，所述的试剂盒包含上述引物组合物。
所述的试剂盒的检测步骤包括：
1)提取待测菌或其他类型待检样品中质粒基因dna
2)以步骤(1)提取的基因为模版，采用上述引物组合物进行对基因mcr-1的环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物或试剂盒可用于检测样本中是否含有耐多粘菌素mcr-1基因或用于检测待检菌是否对多粘菌素耐药。
应用上述引物组合物可以对样品中基因dna模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有耐多粘菌素mcr-1基因；如果不可以对样品中基因dna模版特异性扩增，则待测样品中不含有或不疑似含有耐多粘菌素mcr-1基因。
本发明所述的mcr-1细菌具体可以为大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、难辨梭菌、金黄色葡萄球菌、淋球菌等可能携带mcr-1基因的微生物。
本发明的有益效果为：
本发明提供的用于细菌mcr-1耐药基因的引物组合物，可便捷、快速、准确的检测细菌mcr-1耐药基因。对于实际应用而言，能够在3小时内获得检测结果，对快速辅助药物治疗指导与用药选择具有重要意义。同时，可用于流行病学调研和疫情监控以研究或了解细菌mcr-1耐药基因在中国乃至全球的流行情况。
附图说明
图1是含mcr-1质粒大肠杆菌典型荧光曲线；
图2是不含mcr-1样品荧光曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法
下列实施中所用的试验材料，如无特殊说明，均为本领域常用的实验材料
实施例1
1)试剂盒的组成：
反应液a：2×等温反应混合液，内含bstdna聚合酶，sybrgreen1荧光染料，2mmdntp等；
反应液b:mgso4(50mm)；
反应液c:bstdna聚合酶(8u/ul)；
各引物的dna序列和浓度如下：
f3：tccgtttgttcttgtggcg，浓度为2um
b3：caggctttagcacatagcga.浓度为2um
fip：tccgcgatgggataggtttgggtgttgccgttttcttgacc,浓度为8um
bip：aatctcggctttgtgctgacgacgatgataacagcgtggtga,浓度为8um
lf：aaaaggtaagattggcggtcg,浓度为4um
lb：cgctgtcgtgctctttgg,浓度为4um
反应体系：
荧光定量pcr反应管20ul体系：a液10ul，6种引物各1ul，样本dna9ul。具体如下：
反应条件：65℃恒温水浴箱中放置70min。pcr仪实时检测反应结果。
2)用于检测耐药基因mcr-1检测
样本dna，样本为粪便、动物分泌物，牛乳等，从所测样本中提取dna，调节dna浓度为100ng/ul。
反应结果空白对照组为非s型扩增曲线(附图2)，阳性样品可以扩增类似s曲线(附图1)。
实施例2利用耐药基因mcr-1检测试剂盒检测多粘菌素耐药基因mcr-1
待检测mcr-1片段为具体序列如seqidno：7所示。
在宝生物公司合成上述所述mcr-1被检测片段，构建到puc19质粒，经双酶切与测序鉴定正确无误。转染jm109感受态细胞，转化产物涂板。次日挑选转化菌落，用lb培养基培养。
提取培养菌质粒基因dna。用无菌水做梯度稀释，使每1μl稀释液中含有模板基因拷贝数分别为106，105，104，103，102，10。
反应条件如上。
反应过程中采用荧光pcr采集荧光信号，阳性样品扩增出s型扩增曲线，说明待检样细菌不含有mcr-1基因。否则为阴性，说明待检样细菌不含有mcr-1基因。
按照上述方法，空白对照组将dna模版稀释液替换为无菌水，其他步骤不变，作为空白对照，结果显示，用携带mcr-1的puc19质粒提取的基因稀释液，基因拷贝数分别为106，105，104，103，102。
结果显示，空白对照组为非s型扩增曲线(图2)。反应曲线为s型，并且随着基因拷贝数降低，s型曲线起飞的时间逐渐后延。基因组拷贝数为10的反应曲线非s型扩增曲线。说明该试剂盒的检测灵敏度至少为100个耐药基因mcr-1拷贝。
上述结果显示，检测方法灵敏度为100个耐药质粒基因mcr-1拷贝。
实施例3利用耐药基因mcr-1检测试剂盒检测多粘菌素耐药基因mcr-1
待测样本基因制备：以分离纯培养细菌为例。
用含有硫酸多粘菌素(2mg/l)lb培养基培养携带mcr-1的大肠杆菌，提取培养菌质粒基因dna。
反应体系同实施例2。
结果显示，用含有硫酸多粘菌素(2mg/l)lb培养基培养携带mcr-1的大肠杆菌提取的基因组稀释液，反应曲线为s型。
结果显示，用lb培养基培养不携带mcr-1的大肠杆菌提取的质粒基因和空白对照组为非s型扩增曲线。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>侯晓林
<120>一种用于检测细菌mcr-1基因的引物组合物及应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tccgtttgttcttgtggcg19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caggctttagcacatagcga20
<210>3
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tccgcgatgggataggtttgggtgttgccgttttcttgacc41
<210>4
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
aatctcggctttgtgctgacgacgatgataacagcgtggtga42
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
aaaaggtaagattggcggtcg21
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
cgctgtcgtgctctttgg18