本发明涉及检测串联重复序列技术领域，尤其是涉及一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法。
背景技术：
1982年，hamade等人发现了短串联重复序列(shorttandemrepeat，str)，或称简单重复序列(ssr)，微卫星序列(microsatellitesequence，ms)。真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列，按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星dna（基序100-300bp）、小卫星dna（基序10-60bp）、微卫星dna（基序1-6bp）等。短串联重复序列是由dna复制或修复过程中dna滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的，它的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。短串联重复序列的检测应用范围较为广泛，包括但不限于以下领域：医学分子诊断、法医学鉴定、细胞生物学相关分析等。
尽管串联重复序列分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，现有的技术基本原理都是根据这两端的序列设计一对特异引物，通过pcr技术将期间的核心串联重复序列扩增出来，利用电泳分析技术（可测荧光信号的毛细管电泳技术）就可以得到其长度的多态性。串联重复序列具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点，但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆和测序分析，以便设计相应的引物，这是非常费时、费力和代价昂贵的工作，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的，因而给它的利用带来了一定困难。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，针对目前检测串联重复序列的技术，主要的问题是实验设计复杂、操作繁琐、必须借助昂贵仪器进行检测，而一些分子诊断探针的设计方法又存在探针设计困难、假阳性高的问题，无法应用于法医、临床检测，探针设计困难的原因主要是由于重复的序列会让特异性结合的引物滑动或引起分子诊断用酶的链置换活性，一些基于连接酶和等温扩增酶产生的假阳性主要是由于非特异性连接拷贝数被高活性的等温扩增酶放大的问题，提供一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，从而解决上述问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，包括以下原料与操作步骤。
带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等。
步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯dna模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟。
步骤二、磁珠纯化：1.0×)ampurexp磁珠至上述反应管中，用移液器轻轻吹打10次,充分混匀，室温孵育5分钟，将反应管瞬时离心后，置于磁力架上静置2分钟进行磁珠的分离，待溶液澄清后,小心移除上清，避免接触并吸取磁珠，切记勿弃除磁珠。保持反应管始终置于磁力架上,加入200微升新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清。再用乙醇重复上一步清洗过程一遍，将反应管瞬时离心,并用移液器再次吸尽残留液体，打开反应管盖并保持反应管始终置于磁力架中，将磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥，不要超过5分钟，切记磁珠不要干燥时间太久，造成磁珠干燥过度,影响纯化效果，将反应管从磁力架中取出，加入一定体积灭菌超纯水洗脱dna，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的灭菌反应管中。
步骤三、外切酶消化：加入外切酶组分，37℃反应20分钟，80℃变性15分钟；
步骤四、等温扩增：加入基因工程改造过的快速phi29酶反应体系，37℃反应1.5小时；
步骤五、信号测定：用标准qubit®荧光测定仪程序进行荧光测定，在带有sybrgreen染料的工作液种加入之前等温扩增后的反应体系，避光2分钟后根据标准曲线进行读数确定结果。
作为本发明的一种优选技术方案，所述成环反应体系为聚合酶体系和连接酶体系。
作为本发明的一种优选技术方案，所述外切酶组分为外切酶ⅰ和外切酶ⅲ。
作为本发明的一种优选技术方案，所述标准曲线为终点法。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，节省了操作成本，同比现有技术，无需进行pcr扩增、毛细管电泳等昂贵仪器的复杂操作，仅仅基于金属浴加热模块和荧光测定仪即可精确检测串联重复序列，微卫星基序10个重复以内的检测，节省了操作时间，大幅降低检测成本。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中。
图1为以mif基因catt基序5重复序列纯合子检测为例的检测原理示意图。
图2为用酶标仪对锁型探针检测体系进行荧光扫谱验证示意图。
图3为通过琼脂糖凝胶电泳验证锁型探针检测体系示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，包括以下原料与操作步骤。
带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等。
步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯dna模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟。
步骤二、磁珠纯化：1.0×ampurexp磁珠至上述反应管中，用移液器轻轻吹打10次,充分混匀，室温孵育5分钟，将反应管瞬时离心后，置于磁力架上静置2分钟进行磁珠的分离，待溶液澄清后,小心移除上清，避免接触并吸取磁珠，切记勿弃除磁珠。保持反应管始终置于磁力架上,加入200微升新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清。再用乙醇重复上一步清洗过程一遍，将反应管瞬时离心,并用移液器再次吸尽残留液体，打开反应管盖并保持反应管始终置于磁力架中，将磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥，不要超过5分钟，切记磁珠不要干燥时间太久，造成磁珠干燥过度,影响纯化效果，将反应管从磁力架中取出，加入一定体积灭菌超纯水洗脱dna，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的灭菌反应管中。
步骤三、外切酶消化：加入外切酶组分，37℃反应20分钟，80℃变性15分钟。
步骤四、等温扩增：加入基因工程改造过的快速phi29酶反应体系，37℃反应1.5小时。
步骤五、信号测定：用标准qubit®荧光测定仪程序进行荧光测定，在带有sybrgreen染料的工作液种加入之前等温扩增后的反应体系，避光2分钟后根据标准曲线进行读数确定结果。
成环反应体系为聚合酶体系和连接酶体系，外切酶组分为外切酶ⅰ和外切酶ⅲ，标准曲线为终点法。
实施例1:本发明设计了一种锁型探针，通过同时结合串联重复序列两端的保守序列和部分串联重复序列而起到锚定作用，在针对不同的串联重复序列模板上形成不同的探针结构（比如设计检测“catt”基序五重复序列纯合子，设计多出5个“catt”基序探针结构使得锁型探针内测5’端和3’端退火后3’端翘起无法连接成环，而与六及以上重复基序模板退火时可以成环），再由等温扩增酶对形成环的探针进行扩增，并附加信号放大，实现仅借助水浴锅和荧光检测器（qubit®荧光定量仪）即可实现整个检测过程，可实现不借助昂贵复杂仪器进行串联重复序列的快速检测。
实施例2:本发明设计了一种新型锁型探针（本质是经过修饰的脱氧核糖核酸引物），引物分三个部分，一是与串联重复序列两端非重复且较保守序列互补的序列，二是与串联重复序列（根据检测目的有全部互补和部分互补两种）互补的序列，三是用于后续等温扩增、与模板不重复、能结合特异性等温扩增引物的刚性环结构序列，这种锁型探针在结合串联重复序列区域的同时能够锚定模板，防止连置换和引物滑动，为检测的特异性打下基础。
实施例3:锁型探针上的碱基修饰，锁型探针引物3’末端部分碱基进行了特殊修饰，确保退火的热稳定性和连接效率，提高检测的灵敏度，同时锁型探针引物5’末端进行了磷酸化修饰，3’末端进行了3’羟基保护修饰，但并未进行硫代修饰，这样的修饰方式主要为了防止引物自连的同时便于在后期反应中降解未退火的多余锁型探针引物。
实施例4:拥有聚合酶活性、外切酶活性、连接酶活性的酶促反应体系，在含有特定串联重复序列的模板协助锁型探针形成特定的结构。
实施例5：phi29酶等温扩增和sybrgreen荧光染料结合信号放大，根据特异性与锁型探针结合的双向引物结合成环的锁型探针，经过phi29酶等温扩增后加入荧光染料体系，即可无需pcr仪和毛细管电泳，在qubit®便携荧光检测仪上读取荧光信号拟合的数据。
附图1是以mif基因catt基序5重复序列纯合子检测为例的检测原理示意图，检测5重复序列时，聚合酶无法进行3’-5’方向扩增，连接酶由于未识别到缺刻结构也无法发挥作用，锁型探针不能成环，而检测非5重复序列时，由于聚合酶和连接酶都发挥作用，锁型探针成环，后在phi29酶作用下进行滚环扩增，产生螺旋结构结合染料经qubittm荧光测定仪测定直接读取数据。附图2是用酶标仪对锁型探针检测体系（结合sybr染料后）进行荧光扫谱验证，在520nm附近最大发射峰处可区分阴性（catt基序5重复序列纯合子）和阳性（其他组合）。附图3是通过琼脂糖凝胶电泳验证锁型探针检测体系，m表示dnamarker位置，1和2分别为阴性（catt基序5重复序列纯合子）和阳性（其他组合）样品反应体系。
该种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，节省了操作成本，同比现有技术，无需进行pcr扩增、毛细管电泳等昂贵仪器的复杂操作，仅仅基于金属浴加热模块和荧光测定仪即可精确检测串联重复序列，微卫星基序10个重复以内的检测，节省了操作时间，大幅降低检测成本。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。