本发明涉及生物技术和医学
技术领域：
，具体涉及一种用于检测egfrtki敏感突变的引物和探针。
背景技术：
：表皮生长因子受体egfr(epidermalgrowthfactorreceptor)属于表皮生长因子受体家族(her)，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。egfr锚定在细胞膜上发挥生物学效应，由膜内和膜外两部分组成。膜外部分主要起到接收信号的作用，膜内部分主要通过络氨酸激酶(tyrosinekinase,tk)起向下传导信号的作用。egfr在肿瘤的发生发展中起到至关重要重要的作用，依次设计出了针对egfr-tk的靶向抑制剂(egfr-tkinhibitor,egfr-tki)，阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、转移、血管生成等，促进肿瘤细胞的凋亡。但是，并不是所有肿瘤细胞对egfr-tki都有反应，只有当egfr基因18-21外显子发生egfr-tki敏感突变时，egfr-tki才会发挥较好的肿瘤抑制作用，这类突变占整个东亚人群的～45％。19外显子缺失突变和21外显子l858r突变占所有egfr-tki敏感突变的90％以上。当肿瘤细胞不携带egfr-tki敏感突变时，egfr-tki类药物的有效率将低至10％。因此，在临床实践中，检测egfr-tki敏感突变，对于治疗方案的选取具有重要意义。目前针对egfr-tki敏感突变的常见检测方法包括：sanger测序法、armspcr、数字pcr、第二代测序法等。对于sanger测序法来说，灵明度～1％，整个实验完成需要2-3天的时间，主要针对组织样本。目前，虽然sanger测序法是组织egfr-tki敏感突变检测的金标准，但是缺点也是十分明显的，灵敏度较低，整个实验周期较长。另外对于血液样本来说，sanger测序法比较困难。数字pcr具有高灵敏度的特点，可以达到0.1％。但是数字pcr也有较为严重的缺点，设备价格较高、稳定性不佳、对实验环境要求较高等。另外数字pcr整体上来讲，检测价格也远高于sanger测序法和armspcr。因此，目前数字pcr对于egfr-tki敏感突变的检测也仅仅停留在对t790m突变的检测项目上。第二代测序技术具有高通量、高灵敏性的特点，与此同时也带来了高成、高耗时、高复杂的缺点。因此，第二代测序在实际中也并不适合于egfr-tki敏感突变的检测。当前，最有效检测egfr-tki敏感突变的方法仍然是armspcr。armspcr全名为突变组织扩增系统pcr(amplificationrefractorymutationsystempcr)，灵敏度高达0.1％，样品来源包括组织和血液，并且成本与sangerpcr一样较低，整个检测实验周期不超过一天。目前，现有的egfr-tki敏感突变armspcr检测试剂盒通常包括18外显子、19外显子、20外显子和21外显子上20个以上突变位点的检测。但是，从临床大数据分析来看，其中90％以上的突变集中在19外显子缺失突变和21外显子l858r突变。并且对于没有经过egfr-tki治疗的患者来说t790m和20外显子插入耐药突变的发生率非常低。虽然，目前针对egfr-tki灵敏突变的检测可以包括多种基因部位的突变检测，但是其中大部分都是低概率发生的突变，无形之中增加了检测成本，由此可能会加重病人的治疗负担。技术实现要素：为了克服现有检测方法成本较高的缺点，本发明针对19外显子缺失突变和21外显子l858r突变设计新型的引物和探针，通过优化使egfr-tki敏感突变检测灵敏度保持在90％以上的前提下，减少其他不必要的检测位点，降低检测成本，使更多患者受益。本发明的技术方案具体如下：本发明提供一种用于检测egfrtki敏感突变的引物，其包括用于检测19外显子缺失突变的上游引物e19f以及下游引物e19r-1、e19r-2、e19r-3、e19r-4、e19r-5、e19r-6、e19r-7、e19r-8和e19r-9，用于检测21外显子l858r突变的上游引物l858rf-1、l858rf-2和下游引物l858rr，以及外控上游引物、外控下游引物；其中：上游引物e19f的核苷酸序列如seqidno:1所示，下游引物e19r-1、e19r-2、e19r-3、e19r-4、e19r-5、e19r-6、e19r-7、e19r-8和e19r-9的核苷酸序列分别如seqidno:2～10所示；上游引物l858rf-1、l858rf-2的核苷酸序列如seqidno:12～13所示，下游引物l858rr的核苷酸序列如seqidno:11所示，外控上游引物的核苷酸序列如seqidno：16所示，外控下游引物的核苷酸序列如seqidno：17所示。本发明还提供一种用于检测egfrtki敏感突变的探针，其包括核苷酸序列如seqidno:14所示的用于检测19外显子缺失突变的探针，核苷酸序列如seqidno:15所示的用于检测21外显子l858r突变的探针，以及核苷酸序列如seqidno:18所示的外控探针。本发明中，探针的5’端设有荧光基团fam，3’设有淬灭基团bhq1。本发明还提供一种用于检测egfrtki敏感突变的试剂盒，其包括上述引物和探针。与现有armspcr检测egfrtki敏感突变技术对比，本发明主要有益效果在于，检测时删减了突变率非常低的突变类型，在保证了其他armspcr技术优点的情况下，减少了实验所需的总时间，减少了实验的成本，设计位点仍然覆盖egfrtki敏感突变的90％以上。另外，通过全新的设计19外显子缺失突变和l858r突变的检测引物和探针，能都得到较好的检出效率。附图说明图1为各个突变位点最低检测限。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细阐述。本发明根据19外显子缺失常见的10种突变(e746-a750del(ⅰ)；e746-t750deli；e746-t751dela；e746-s752delv；e746-a750del(ⅱ)；l747-t751del；l747-s752del；l747-a750delp；l747-p753dels；l747-t751delp)和21外显子l858r突变的特点，设计了相应的引物和探针，引物和探针如表1所示。表1引物与探针本发明中还包括一种用于检测egfrtki敏感突变19外显子缺失突变和21外显子l858r突变的试剂盒，其中包括了上述的引物和探针，还包括了含有taq酶、dntp、10×buffer和mgcl2的pcr反应液。pcr反应体系如表2所示。10×buffer配方如表3所示。表2一份pcr反应液原料加入量10×buffer2.5μl25mmmgcl23μltaq酶0.25μl模板2μl25mmdntps2.5μl上游引物0.25μl下游引物0.25μl探针0.25μlddh2o将总体积补至25μl表310×buffer(总体积1毫升)原料加入量1mtris100μl1mkcl500μltritonx-10010μlte390μl具体实验步骤：1、首先取三个pcr反应管，分别用于检测19外显子缺失突变(管1)、l858r突变(管2)和egfrtk外控基因(管3)。其中egfrtk外控基因的检测用于判断本次提取是否成功，以及与检验管对比判断排查阴性阳性。具体判断方法是完成pcr实验后，通过计算δct的大小进行判断，若待检样本dna的ct(外控)>30，提示样本dna浓度过低或降解严重，建议更换样本或重新提取dna；若待检样本dna的ct(外控)≤30，则计算其δct(ct(突变)-ct(外控))；若δct>8(或者ct(突变)无显示)，判断为野生型；若δct≤8，判断为突变型。2、向三个pcr反应管中加样。管1加入pcr反应物如表4所示。管2加入pcr反应物如表5所示。管3加入pcr反应物如表6所示。表4管1加样列表原料加入量10×buffer2.5μl25mmmgcl23μltaq酶0.25μl模板2μl25mmdntps2.5μle19f0.25μle19r-10.25μle19r-20.25μle19r-30.25μle19r-40.25μle19r-50.25μle19r-60.25μle19r-70.25μle19r-80.25μle19r-90.25μle19r-probe0.25μlddh2o12μl表5管2加样列表表6管3加样列表原料加入量10×buffer2.5μl25mmmgcl23μltaq酶0.25μl模板2μl25mmdntps2.5μl外控f0.25μl外控r0.25μl外控probe0.25μlddh2o14μl3、将管1、管2和管3放入实时荧光定量pcr仪中进行反应，反应条件为：4、分析数据。实施例1检测引物、探针的检测限、灵敏性和特异性分别构建含有19外显子缺失突变、l858r突变的质粒，质粒中对应的构建序列如表7所示，包括10个19外显子确实突变、l858r突变、19外显子野生型、l858r野生型。用带有19外显子、l858r野生型质粒样本对突变质粒进行1倍、10倍、100倍、1000倍稀释后，用上述设计的引物、探针和pcr试剂盒进行检测，从而获得各个检测位点的最低检测限。结果如图1所示，每个突变位点的最低检测限为1％。当循环数为27-31的时候，如图可知突变率在0.1％-1％之间，此时为疑似突变阳性，需要再次提取dna进行重复测试。表7质粒检测序列用带有19外显子、l858r野生型质粒样本对突变质粒进行100倍稀释后，用上述设计的引物、探针和pcr试剂盒对100份稀释后样本进行检测，结果显示19外显子突变检出98份，灵敏度为98％，l858r突变检出99份，灵敏度为99％。对19外显子、l858r野生型质粒样本用上述设计的引物、探针和pcr试剂盒进行特异性检验。做100份重复，实验结果显示19外显子突变检出1份，特异性为99％，l858r突变检出0份，特异性为100％。实施例2检测肺癌患者血液cfdna的egfrtki敏感性突变。实验方法如下：1、取5ml肺癌患者血液。2500转离心10min，取1ml上层血浆。2、向血浆中加入200μl的5％sds裂解液。3、加入等体积饱和酚溶液，轻柔震荡5min，5000g离心15min，取上清。4、向上清中加入等体积氯仿，震荡5min，3000g离心10min，取上清。5、向上清中加入三倍体积冻乙醇混合，12000转离心2min，dna沉于管底，小心弃去液体。6、挥干管底剩余液体，加入50μlte溶解dna沉淀。7、将得到的dna用上述引物、探针和pcr试剂盒进行egfrtki敏感性突变检测。此实施例一共选取了50例患者，患者组织样本均通过金标准sanger测序进行验证，其中20例的组织样本为19外显子突变阳性，10例的组织样本为l858r突变阳性，20例为组织阴性样本。通过对相应cfdna的egfrtki进行测试，20例组织19外显子突变阳性检出17例，10例组织l858r突变阳性检出9，20例组织阴性检出0例。总体的准确性为86.7％，与金标准相比，一致性较高。虽然，不能完全达到金标准的准确性，但是对于一些无法得到组织样本的特殊患者来说，血液cfdna的检测仍然是一种很好的替代方法。实施例3检测肺癌患者组织dna的egfrtki敏感性突变。实验方法如下：1、取黄豆大小新鲜组织，加入200μl10mg/ml蛋白酶k溶液，70度孵育1h。3、加入等体积饱和酚溶液，轻柔震荡5min，5000g离心15min，取上清。4、向上清中加入等体积氯仿，震荡5min，3000g离心10min，取上清。5、向上清中加入三倍体积冻乙醇混合。6、将混合后的液体加入到dna分离柱中，12000转离心1min，弃去下部液体。7、加入500μl75％乙醇溶液到分离柱中，12000转离心1min，弃去下部液体。8、敞开放置离心柱挥干乙醇，加入50μlte洗脱dna。9、将得到的dna用上述引物、探针和pcr试剂盒进行egfrtki敏感性突变检测。此实施例回顾性随机选取了30例中国籍二期肺癌手术蜡块组织进行实验，其中10例男性、10例女性，均无吸烟史。结果显示，有16例患者检出egfrtki敏感性突变，突变率为53.3％，高于文献报道的东亚人群突变率～45％。这是由于非吸烟人群的突变率高于吸烟人群，本次验证实验均无吸烟史，因此检出率略高，与文献相符。序列表<110>上海浦美生物医药科技有限公司<120>一种用于检测egfrtki敏感突变的引物和探针<160>30<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列(e19f)<400>1actgggcagcatgtggca18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-1)<400>2cttgttggctttcggttc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-2)<400>3tgttggctttcggaacct18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-3)<400>4tggctttcggagatgcct18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-4)<400>5gttggctttcggagattc18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-5)<400>6ggctttcggagatatttt18<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列(e19r-6)<400>7ggctttcggagatgtttt18<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(e19r-7)<400>8tgttggctttcggagatgcc20<210>9<211>16<212>dna<213>人工序列(e19r-8)<400>9tggctttcggagatgg16<210>10<211>17<212>dna<213>人工序列(e19r-9)<400>10gctttcggagatgttgg17<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(l858rr)<400>11cacccagcagtttggcac18<210>12<211>18<212>dna<213>人工序列(l858rf-1)<400>12cacccagctgtttggcac18<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(l858rf-2)<400>13tcagggcatgaactacttgg20<210>14<211>26<212>dna<213>人工序列(e19r-probe)<400>14agagtccctatgacagagagagaagg26<210>15<211>22<212>dna<213>人工序列(l858r-probe)<400>15tgatcttgacatgctgcggtgt22<210>16<211>16<212>dna<213>外控f(人工序列)<400>16tgtcctggcacccaag16<210>17<211>20<212>dna<213>外控r(人工序列)<400>17cagagacaagggtcacctca20<210>18<211>22<212>dna<213>外控probe(人工序列)<400>18tggaaagcagtgccagacatgg22<210>19<211>184<212>dna<213>质粒检测序列1(人工序列)<400>19taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggaaccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgc180tgtg184<210>20<211>184<212>dna<213>质粒检测序列2(人工序列)<400>20taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggttccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctttgc180tgtg184<210>21<211>187<212>dna<213>质粒检测序列3(人工序列)<400>21taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggcatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctt180tgctgtg187<210>22<211>187<212>dna<213>质粒检测序列4(人工序列)<400>22taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggaatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctt180tgctgtg187<210>23<211>187<212>dna<213>质粒检测序列5(人工序列)<400>23taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaaatatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctt180tgctgtg187<210>24<211>187<212>dna<213>质粒检测序列6(人工序列)<400>24taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctt180tgctgtg187<210>25<211>187<212>dna<213>质粒检测序列7(人工序列)<400>25taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaagacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctgctt180tgctgtg187<210>26<211>190<212>dna<213>质粒检测序列8(人工序列)<400>26taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggaaccatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagtttctg180ctttgctgtg190<210>27<211>193<212>dna<213>质粒检测序列9(人工序列)<400>27taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggaaccaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgtgagttt180ctgctttgctgtg193<210>28<211>202<212>dna<213>质粒检测序列10(人工序列)<400>28taacatccacccagatcactgggcagcatgtggcaccatctcacaattgccagttaacgt60cttccttctctctctgtcatagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcc120cgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcga180tgtgagtttctgctttgctgtg202<210>29<211>213<212>dna<213>质粒检测序列11(人工序列)<400>29ggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgta60ctggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggcgggccaaactgctgggt120gcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagc180cagcattttcctgacaccagggaccaggctgcc213<210>30<211>213<212>dna<213>质粒检测序列12(人工序列)<400>30ggcatgaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgta60ctggtgaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggt120gcggaagagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagc180cagcattttcctgacaccagggaccaggctgcc213当前第1页12