本发明涉及一种丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi，amf）单个孢子pcr预处理的方法，具体是一种采用amf单个孢子微量dna进行pcr预处理的方法，属于菌种检测领域。
背景技术：
丛枝菌根真菌（arbuscularmycorrhizalfungi，amf）是土壤中广泛与植物共生的一类真菌，其种类繁多，现在已经被单独规划为球囊菌门。由于其与植物建立互利共生的关系，所以人们需要致力于鉴定和发现不同特性的菌株或新菌种。但在鉴定与发现新菌种的过程中，由于不同菌种形态特征难于辨别，不得不借助于分子鉴定。amf的分子鉴定即采用amf单个孢子的dna作为模板，通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，pcr)扩增特定区域的基因片段，通过比对该基因片段与已知菌种的同源基因片段的异同来鉴定菌种。虽然amf分子鉴定由来已久，但由于amf孢子的孢子壁厚，关于采用amf单个孢子微量dna进行pcr预处理的方法过于繁琐或成本比较昂贵，例如采取反复冷热交替的方法使单个孢子破碎，然后再小心的转移单个孢子内微量dna进行pcr；还有特定公司采用成本昂贵的裂解液进行提取单个孢子dna，并实行技术封锁。这些程序繁琐或成本昂贵的预处理方法增加了amf分子鉴定的阻力。目前，尚没有一种简单廉价且可操作性强的预处理方法，既能简单的将amf单个孢子破壁又有利于单个孢子内微量dna转移进入pcr体系。
技术实现要素：
本发明的目的是克服目前传统amf单个孢子pcr预处理方法所存在的缺陷，而公开一种采用amf单个孢子微量dna进行pcr预处理的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
a.通过湿筛倾析获得若干个amf孢子，将一定数量的amf孢子在无菌水中超声清洗，抽滤在无菌滤纸上，并放置于超净工作台内，以下步骤均在超净工作台内进行；
b.用灭菌的剪刀将无菌pcr管盖剪出一个平整的小方片，放置在无菌滤纸上；
c.将无菌滤纸放置在解剖镜载物台上，使用火焰灭菌的微量注射器针头在小方片上扎出一个小坑；
d.使用火焰灭菌的解剖针挑取一个饱满未开裂的amf孢子放在小坑内；
e.用微量注射器吸取无菌甘油，在解剖镜下利用微量注射器的针头将amf单个孢子在小坑内压碎，然后推出无菌甘油，以清洗掉残留在针头上的单个孢子内含物；
f.用火焰灭菌的镊子将带有amf单个孢子破碎物与甘油的小方片放入pcr管底部，完成预处理过程，再加入pcr所需要的正反引物、taq酶和pcr级别的无菌水，快速离心，即可进行pcr。
本发明利用微量注射器针头来制造小方片上的小坑，将amf单个孢子放入小坑中，针状的微量注射器针头可将坑底的amf单个孢子压破，使其dna等内含物出来，再利用微量注射器内无菌甘油快捷地清洗可能沾有amf单个孢子内含物的针头，加之甘油又能提高微量dna的pcr扩增效率。将amf单个孢子dna等内含物暴露在无菌小方片上，可直接将其放入pcr管底部，便与pcr的其他反应液接触，进行pcr反应，所涉及的装置易获得，可重复利用，操作简单，可行性高，成本低廉。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，以下实施例只是为了解释本发明而不是限制本发明：
本发明解决其技术问题所采用的具体技术方案是：
a.通过湿筛倾析收集菌根植物根系以及根际土中的amf孢子，在体式显微镜下挑取100个amf孢子于含有0.5ml无菌水的1.5ml离子管中超声清洗10min，抽滤在无菌滤纸上，并放置于超净工作台内，以下步骤均在超净工作台内进行；
b.用灭菌的剪刀将无菌pcr管盖剪出一个2×2mm平整的小方片，放置在无菌滤纸上；
c.将无菌滤纸放置在解剖镜载物台上，使用火焰灭菌的微量注射器针头在小方片上扎出一个0.5mm深的小坑；
d.使用火焰灭菌的解剖针挑取一个饱满未开裂的amf孢子放置于小坑内；
e.用微量注射器吸取1μl无菌甘油，在解剖镜下使用微量注射器的针头将amf单个孢子在小坑内压碎，然后推出1μl无菌甘油，以清洗掉残留在针头上的单个孢子内含物；
f.用火焰灭菌的镊子将带有amf单个孢子破碎物与甘油的小方片放入pcr管底部，完成预处理过程，再加入pcr所需要的浓度为10mm的正反引物各0.5μl、10μl2×taq酶mix和8μlpcr级别的无菌水，快速离心，即可进行pcr。