本发明涉及一种高密度培养大肠杆菌细胞的方法。更确切地说，本发明涉及一种培养大肠杆菌细胞以使其增殖增到最大的方法，其包含使大肠杆菌细胞生长和诱导重组蛋白表达以使细胞质量和重组蛋白的量增到最大的步骤。
背景技术：
大肠杆菌由于其可用于大肠杆菌的培养和基因工程的高生长速率和发酵学和基因工程领域中的先进技术而成为大批量生产各种有用蛋白质最常使用的宿主细胞。高产量生产重组蛋白需要以高密度培养转型的大肠杆菌细胞。为此目的，已开发不同类型的培养基，如复合培养基、合成培养基和半合成培养基，以及各种进给培养基的方法，如恒定速率进给、逐步增加进给速率、指数进给或特定生长速率控制、恒酸度(ph-stat)和恒溶氧(do-stat)控制以及葡萄糖和乙酸浓度控制且用于获得高细胞密度的大肠杆菌。但实际上，培养转型菌株中的每一种均有特定方法和最佳条件。因此，对于高产量蛋白质生产，重要的是选择进给培养基和培养细胞的最佳方法。
一般来说，在通过重组大肠杆菌生产重组蛋白中，对应启动子和表达蛋白的特征影响细胞的每一单元的细胞生长速率和生产率。对于蛋白质表达通过强启动子控制的系统，重组蛋白的快速表达可以打破宿主细胞的能量代谢平衡，进而抑制细胞生长。尤其当表达蛋白对宿主细胞具有直接负面影响时，其在较大程度上抑制宿主细胞的生长。
由于这些原因，强诱导型启动子下的蛋白质表达变为宿主细胞的重大负担。因此，当此负担降到最小时，可以更容易地实现重组蛋白的大批量生产。考虑以上条件，最佳表达时间可以视表达蛋白的特征而变化，即使在使用相同类型的表达载体和宿主细胞进行蛋白质表达时也是如此。另外，表达时间对细胞生长和表达速率的影响的显著性可以有所变化。此外，细胞生长速率和细胞质量影响蛋白质生产。在每细胞生产率相同的情况下，使用较高质量的细胞可以增加蛋白质生产的产量。因此，重要的是在通过重组微生物生产重组蛋白中建立以高密度生产细胞团块的最佳培养条件。
由于转型大肠杆菌的蛋白质表达与关于生长环境的各种胞内生理/生态因子(质粒复制品的稳定性和数目、转录和转译效率、表达蛋白的溶解度、蛋白分解、膜完整性等)密切相关，所以建立最佳培养条件以使生产量和生产率增到最大为至关重要的。因此，为了以高产量表达重组蛋白，需要添加适当诱导物，如iptg，并且需要通过适当方法将具有适用于蛋白质生产的组合物的培养基进给到高密度重组大肠杆菌的培养基中。必要时，必须改进培养基组合物和进给其的方法以用于重组蛋白生产(易(yee)和布兰奇(blanch),1992,生物技术(bio/technol.)10,1550-1556)。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的方法可以分成三种代表性类型。第一种方法为将重组蛋白表达为大肠杆菌细胞的细胞质中的可溶形式。第二种方法为使用信号序列将重组蛋白表达到大肠杆菌细胞的胞外质。另一种方法为以包涵体(ib)形式表达蛋白质，且此方法最常用于在高产量下表达蛋白质。
当以ib形式表达蛋白质时，需要以高密度培养大肠杆菌细胞。详细地说，在每一细胞具有类似蛋白质表达的情况下，当大肠杆菌细胞在较高密度下生长时，可以获得较高产量的蛋白质产物。因此，已存在许多关于研究以高密度生长大肠杆菌细胞的方法的研究。韩国专利第10-0235315号公开一种融合蛋白质用于过度表达人类生长激素的用途，但发现细胞质量为约90到100克/升。此外，观察到两步发酵条件下的重组蛋白生产过程中，最终吸光度(od600)不高于150(微生物细胞工厂(microbcellfact.)2008年8月7日；7:26)。同样，生产像萨莫辛(salmosin)的蛋白质的高密度培养条件每升仅产生65.70gib(微生物学与生物技术期刊(jmicrobiolbiotechnol.)2011年10月21日；(10):1053-6)。另外，生产ifnγ的培养条件每升细胞培养物仅产生约100g细胞团块(工业微生物学与生物技术杂志(jindmicrobiolbiotechnol.)2004年2月；31(2):63-9.电子版2004年2月19日)。因此，对于开发一种以较高密度培养大肠杆菌细胞的方法仍有很高需求。
基于此背景，在努力开发一种以高产量生产重组蛋白的方法的过程中，本发明人已发现当在培养转型大肠杆菌细胞的步骤与诱导重组蛋白的表达的步骤之间用不同类型的培养基培养宿主细胞时，可以实现转型大肠杆菌中重组蛋白的大批量生产，进而完成本发明。
技术实现要素：
技术难题
因此，本发明的一个目标为提供一种高密度培养大肠杆菌细胞的方法。
技术解决方案
作为实现本发明的目标的一个实施例，本发明提供一种高浓度培养大肠杆菌细胞的方法。
具体来说，本发明提供一种培养大肠杆菌细胞的方法，其包含(i)在细胞生长培养基中以分批培养模式培养大肠杆菌细胞直到培养基的ph增加0.1或大于0.1；(ii)在细胞培养基的ph增加时通过添加第一进料培养基以分批进料培养模式培养大肠杆菌细胞；以及(iii)在细胞培养物中600nm下的吸光度(od600)增加150或大于150时通过添加第二进料培养基以分批进料培养模式培养大肠杆菌细胞。
为了本发明的目标，大肠杆菌可以是表现重组蛋白的转型大肠杆菌。
如本文所用，术语“细胞生长培养基”是指用于生长大肠杆菌细胞的培养基。出于本发明的目的，细胞生长培养基可以包含为大肠杆菌提供生长环境的初始培养基，和控制ph并促进大肠杆菌生长的痕量金属溶液，但不限于此。初始培养基的类型不限，但优选地含有胰蛋白胨、酵母提取物、nacl、kh2po4和(nh4)2hpo4。并且痕量金属溶液不限，但其优选地含有柠檬酸、fecl2、h3bo3、mncl2、cucl2、na2moo4、cocl2、zncl2和edta。此外，细胞生长培养基可以优选地由20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、10g/lnacl、207.5g/lkh2po4、50g/l(nh4)2hpo4、268g/l柠檬酸、270g/lfecl2、30g/lh3bo3、100g/lmncl2、15g/lcucl2、25g/lna2moo4、25g/lcocl2、20g/lzncl2和0.5medta组成。任选地，细胞生长培养基可以包含所属领域的技术人员选择的额外组分。
本发明的方法可以进一步包含在进行步骤(iii)期间或之后诱导重组蛋白的表达。优选地，可以与进行步骤(iii)同时诱导大肠杆菌以表达重组蛋白。更优选地，可以将用于蛋白质表达的诱导物添加到第二进料培养基中。此外，可以通过添加异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)诱导重组蛋白的表达。更优选地，添加的iptg的浓度可以为0.1到0.5mm。优选地，当细胞培养物的600nm下的吸光度(od600)增加到120或大于120时添加iptg。
根据另一实施例，在步骤(iii)中于含有iptg的第二进料培养基中培养hm11201(kccm-10660p)(其为经转型以表达免疫球蛋白fc片段的大肠杆菌菌株)以诱导重组蛋白的表达。
如本文所用，术语“转型大肠杆菌”是指一种大肠杆菌菌株，当其通过表达载体携载时或当其插入到染色体dna中时向其中引入编码相关蛋白的聚核苷酸，并且其可以表达和产生相关重组蛋白。出于本发明的目的，未对聚核苷酸、表达载体和通过大肠杆菌产生的重组蛋白赋予特定限制。作为更方便的表达系统，可以采用含有乳糖操纵子(lacoperator)的表达载体。在此状况下，iptg(异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)可用作诱导相关重组蛋白的表达的诱导物。在本发明的一个实施例中，转型大肠杆菌为大肠杆菌hm11201(kccm-10660p)，其可以表达免疫球蛋白fc片段(韩国专利第824505号)。
术语“分批培养”在与细菌培养物结合使用时是指一种培养过程，其中细胞生长于包含最初供应的材料和养分的培养基中。尽管遭受不能够补充养分的缺点，但分批培养享有对于条件不可能调节或易于被污染的培养保证高成功率的优势。因此，分批培养主要用于开发阶段或实验室层面。出于本发明的目的，进行分批培养直到转型大肠杆菌细胞进入实质性增殖期以增加细胞培养物的ph。在这点上，使分批培养持续到细胞培养物的ph比初始培养基的ph增加0.1的时间点。
如本文所用的术语“第一进料培养基”是指在分批培养之后大肠杆菌开始增殖并且ph增加的时间点通过分批进料型方式进给以促进大肠杆菌生长的培养基。出于本发明的目的，第一进料培养基包含酵母提取物和葡萄糖，并且可以添加到细胞生长培养基中。第一进料培养基中的酵母提取物和葡萄糖的量不受特定限制，但可以由所属领域的技术人员恰当地确定。优选地，第一进料培养基含有量为200到400g/l的酵母提取物和量为700到800g/l的葡萄糖。
如本文所用的术语“第二进料培养基”旨在指以分批进料型培养使用以将大肠杆菌生长诱导到某一水平以表达和产生相关重组蛋白的培养基。出于本发明的目的，第二进料培养基包含酵母提取物和葡萄糖，并且可以添加到细胞生长培养基中。任选地，第二进料培养基可以包含诱导重组蛋白，如iptg的表达的诱导物。未对酵母提取物、葡萄糖和iptg的量赋予特定限制，但其可以由所属领域的技术人员确定。优选地，第二进料培养基含有量为200到400g/l的酵母提取物和量为500到700g/l的葡萄糖，并且任选地含有量为0.1到0.5mm的iptg。
术语“分批进料培养”在与细胞培养物结合使用时是指一种培养过程，其中在发酵开始到完成的整个发酵过程中将养分培养基以控制方式进给到发酵器中，并且不从发酵器提取细胞培养物。在分批进料型培养中，以与微生物的吸收速率成比例的速率进给相关养分以使得可以将培养物中的养分浓度控制到预定值。在有此优势之情况下，采用分批进料型培养研究具有底物反馈、产物反馈或增殖反馈的发酵，并且应用于与面包酵母、氨基酸、抗生素材料等相关的发酵工业中。出于本发明的目的，分批进料培养可以应用于在生长到某一水平的大肠杆菌中生产相关重组蛋白。
优选地，本发明的培养条件可指以单一过程形式进行分批培养和分批进料培养且不分隔开的系统。
根据本发明培养转型大肠杆菌细胞的方法可以为恒酸度过程，其中在ph增加时依序进给第一和第二进料培养基，同时以分批培养来培养重组大肠杆菌。关于这一点，第一进料培养基可以逐步递增方式进给，而第二进料培养基可以逐步递减方式进给。恒酸度发酵为一种分批进料过程，其中在不考虑溶解氧气的浓度的情况下，在ph由于养分消耗而上升时进给养分。根据恒溶氧，当由底物消耗而造成溶氧浓度上升时进给养分。但是，对于大肠杆菌，恒溶氧发酵是不当的，因为大肠杆菌在厌氧和好氧条件下均可以生长。在本发明中，仅将指示养分消耗的ph上升用作细胞生长的指数。因此，本发明提供一种基于更精确参比的高细胞密度培养方法。
根据本发明的大肠杆菌的培养方法，优选地，在以400到800转/分钟的速度搅拌下以200到400ml/h的速率进给步骤(ii)中的第一进料培养基，且在以400到800转/分钟的速度搅拌下以200到400ml/h的速率进给步骤(iii)中的第二进料培养基。更优选地，根据菌株的特定生长速率，步骤(ii)中的第一进料培养基的进给速率和搅拌速度分别可以在200到400ml/h范围内和400到800ml/h范围内逐步增加。举例来说，增加进给速率和搅拌速度可以包括总共3、4或5个步骤，并且优选地为3个步骤。更具体来说，可以通过以3个步骤增加第一进料培养基的进给速率和搅拌速度进行以上方法，其中首先在以400到600转/分钟的速度搅拌下以200到300ml/h的速率，且随后在以500到700转/分钟的速度搅拌下以250到350ml/h的进给速率，且最后在以600到800转/分钟的速度搅拌下以300到400ml/h的进给速率进给第一进料培养基。确切地说，在步骤1中，在以400到600转/分钟的速度搅拌下以200到300ml/h的速率进给第一进料培养基；在步骤2中，在以500到700转/分钟的速度搅拌下以250到350ml/h的速率进给第一进料培养基；且在步骤3中，在以600到800转/分钟的速度搅拌下以300到400ml/h的速率进给第一进料培养基。更优选地，可以在步骤1中，在以400到550转/分钟的速度搅拌下以200到270ml/h的速率；在步骤2中，在以550到650转/分钟的速度搅拌下以270到300ml/h的速率；且在步骤3中，以650到800转/分钟的速度搅拌下以300到350ml/h的速率进给第一进料培养基。
甚至更优选地，可以如下进行本发明中的培养大肠杆菌细胞的方法：逐步减小通过消耗养分培养基诱发蛋白质表达的步骤(iii)中的第二进料培养基的进给速率和搅拌速度，根据ph变化，进给速率在200到400ml/h范围内且搅拌速度在400到800转/分钟范围内。举例来说，减小进给速率和搅拌速度可以包括总共3、4或5个步骤，并且优选地为3个步骤。具体来说，可以通过以3个步骤减小第一进料培养基的进给速率和搅拌速度进行以上方法，其中首先在以600到800转/分钟的速度搅拌下以300到400ml/h的速率，且随后在以500到700转/分钟的速度搅拌下以250到350ml/h的进给速率，且最后在以400到600转/分钟的速度搅拌下以200到300ml/h的进给速率进给第一进料培养基。确切地说，在步骤1中，在600到800转/分钟的速度搅拌下以300到400ml/h的速率；在步骤2中，在以500到700转/分钟的速度搅拌下以250到350ml/h的速率；且在步骤3中，在以400到600转/分钟的速度搅拌下以200到300ml/h的速率进给第二进料培养基。更优选地，在步骤1中，在以650到800转/分钟的速度搅拌下以300到350ml/h的速率；在步骤2中，在以550到650转/分钟的速度搅拌下以270到300ml/h的速率；且在步骤3中，在以400到550转/分钟的速度搅拌下以200到270ml/h的速率进给第二进料培养基。
根据本发明的一个实施例，在37℃下，在以1vvm的速率通气下于痕量金属补充的生长培养基中以分批培养来培养转型大肠杆菌hm11201，且随后当ph上升时，进给第一进料培养基以进行分批进料培养25到30小时，直到600nm下的吸光度(od600)达到120到180(实例1-1)。在od600为120到180下，在各种条件下进给第二进料培养基以产生相关重组蛋白(实例1-2)。确切地说，在od600为150或大于150下诱导重组蛋白的表达使得大肠杆菌细胞最后生长到od600为200或大于200并且密度为200g/l或大于200g/l。
本发明的有利效果
如上文所述，经转型以产生相关重组蛋白的大肠杆菌可以使用本发明的培养方法以高浓度生长。因此，本发明的方法增加了细胞的生产率以及重组蛋白的生产量，并且可以广泛应用于有效生产重组蛋白。
附图说明
图1显示转型大肠杆菌hm11201(kccm-10660p)的生长曲线(图1a)，以及如通过电泳测量的蛋白质的表达量(图1b)。(图1a)灰线的意思是温度，粗线的意思是ph，点线的意思是搅拌速度，且细线的意思是通气速率。
具体实施方式
对于本发明的较充分理解可以通过以下实例获得，阐述所述实例是为了说明本发明，但不应视为限制本发明对于。
实例1：hm11201的发酵
将经转型以表达免疫球蛋白fc片段的大肠杆菌菌株hm11201(kccm-10660p)选择为代表性菌株并且用于为实现高密度细胞培养和高产量表达的目标根据恒酸度分批进料发酵以逐步方式使培养基进给方法最优化。
实例1-1：建立转型大肠杆菌的高密度细胞培养条件
在37℃下，在以1vvm通气下于初始培养基(胰蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，nacl10g/l，kh2po4207.5g/l，(nh4)2hpo450g/l，ph6.7)中以分批培养形式，且随后使用补充有痕量金属溶液(柠檬酸268g/l，fecl2270g/l，h3bo330g/l，mncl2100g/l，cucl215g/l，na2moo425g/l，cocl225g/l，zncl220g/l以及edta0.5m)的第一进料培养基(酵母提取物300至400g/l和葡萄糖700至800g/l)以分批进料方式培养转型大肠杆菌。
当细胞生长到一定水平并且细胞培养物的ph由于培养基中的养分，尤其为碳源的消耗而增加到高于pid[p(比例)，i(积分)，d(微分)]控制数时，出现长期忽视的代谢变化和大肠杆菌生长以及细胞溶解。为解决此问题，以按菌株的特定生长速率的比例的逐步方式通过分批进料方式进给进料培养基。在进料培养基的进给速率超出菌株的生长速率的情况下，大肠杆菌的代谢和生长由于乙酸酯的积聚而得到抑制。因此，随着进给速率以逐步方式增加，搅拌速度同样增加。详细地说，当采用50l发酵器时，在细胞密度高于7×109个细胞/毫升的步骤中，在步骤1中，在以400到600转/分钟的速度搅拌下以200ml/h到300ml/h的速率进给第一进料培养基。另一方面，在细胞密度为2×1010到3×1010个细胞/毫升的步骤中，在以500到700转/分钟的速度搅拌下以250ml/h到350ml/h的速率进给第一进料培养基。另外，在细胞密度为3×1010到4.5×1010个细胞/ml的步骤中，在以600到800转/分钟的速度搅拌下以300到400ml/h的速率进给第一进料培养基，且当细胞密度高于4.5×1010时，第一进料培养基的进给速率和搅拌速度保持恒定于细胞生长不受阻的范围内的最大值处。
在所述条件下培养25到30小时使转型大肠杆菌生长到od600为120至180。
实例1-2：建立高产量生产重组蛋白的培养条件
为建立表现来自实例1-1中培养的大肠杆菌hm11201的蛋白质的最佳条件，将各种组合物用作第二进料培养基并且在各种速率下进给。
结果，发现包含浓度为200到400g/l的酵母提取物和浓度为500到700g/l的葡萄糖的组合物适用于作为第二进料培养基以在高产量下表达重组蛋白。
另外，培养基的进给速率和搅拌速度以逐步方式减小以通过在分批进料培养中消耗养分培养基和控制搅拌条件将所述过程从菌株的生长步骤转化为重组蛋白的生产步骤。详细地说，进给速率和搅拌速度的逐步控制为与ph增加和碱性溶液的输入量成比例进行控制。进给速率和搅拌速度对于步骤1分别设定成300到400ml/h和600到800转/分钟，对于步骤2分别设定成250到350ml/h和500到700转/分钟，且对于步骤3分别设定成200到300ml/h和400到600转/分钟。为诱导蛋白质表达，添加0.1到0.5mm异丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)。
在培养过程后期，为促进重组蛋白的表达，减小大肠杆菌活性。此时，添加过量培养基致使大肠杆菌稀释且乙酸积聚、减少大肠杆菌的生长且因此减少重组蛋白的表达。为解决这些问题，通过在培养过程后期以减小的速率进给进料培养基来减少进给到大肠杆菌的养分。减少养分提供会改变大肠杆菌的代谢，使得铵离子释放到培养基中，其转而增加培养基的ph。因此，观测到细胞培养物维持在6.8到7.5的ph下直到培养完成，即使当未对不变的ph范围进行额外调节时也是如此(图1)。图1显示转型大肠杆菌hm11201(kccm-10660p)的生长曲线，和如通过电泳测量的重组蛋白的表达量。如在图1中可见，来自大肠杆菌的相关重组蛋白的产量与所给时间量成比例地增加。
同时，在进料培养基的组成和iptg的进给时间变化的情况下培养转型大肠杆菌。结果，对于大肠杆菌增殖，当在培养的早期期间持续较长时间段培养细胞以达到细胞培养物的可能的最高密度并且随后在培养的后期期间诱导目标重组蛋白表达时，大肠杆菌的增殖可以增到最大，进而增加菌株的生产率(表1)。在45小时培养之后，测量最终od600、最终细胞质量和蛋白质。
表1
[表1]
根据培养基的组成和表达诱导的时间产生的细胞质量。
如从表1的数据理解，可以根据进料培养基的组成和表达诱导的时间获得200或大于200的最终od600和200g或大于200g的细胞质量。
如在图1中可见，免疫球蛋白fc可以高量地表达，伴以细胞质量的1.5倍增加。因此，本发明中建立的条件对于提高生产率有效，且本发明的方法在以高产量表达蛋白质中有利。
尽管为了说明性目的公开了本发明的优选实施例，但所属领域的技术人员将了解，可在不脱离如随附权利要求书所公开的本发明的范围和精神的情况下进行各种修改、添加与替换。