本发明涉及肿瘤治疗领域，具体而言，涉及一种高细胞毒性的cik细胞制剂及其培养方法。
背景技术：
：癌症作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害着人类健康，已成为人类的第一杀手。生物免疫治疗是目前一种新兴的治疗手段，它主要是通过体外扩增培养免疫细胞，再回输到体内，可增强患者的免疫力。这种生物免疫治疗的杀癌力强、杀癌谱广、杀除残余的癌细胞，其对正常细胞无损伤，且能恢复手术造成的损伤、提高化疗的敏感性，减轻副作用，恢复体力，缓解症状，延长癌症患者的生存期。近些年来，过继免疫细胞治疗，如细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkiller，cik)、til(tumorinfiltratinglymphocyte，til)、cart、ctl等在多种恶性实体瘤如肺癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌等的治疗中，获得了显著的临床效果。cik是一类异质性细胞，其可同时表达cd3+和cd56+两种膜蛋白分子，故又被称为nk细胞样t淋巴细胞。在正常人的外周血中少见，仅占1～5％，其既具有t淋巴细胞抵抗肿瘤细胞，又具有nk细胞杀伤肿瘤细胞的活性。然而，由于肿瘤病人的免疫功能受损，免疫细胞功能减弱，采用现有技术制备的cik细胞杀伤肿瘤能力低下，影响cik疗效。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种高细胞毒性的cik细胞制剂及其培养方法，通过这种培养方法，可缩短细胞培养时间，且得到的cik细胞制剂中细胞活性大于95％，回输后可以增强患者自身的免疫力，增大抗肿瘤效应。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种高细胞毒性的cik细胞的培养方法，其包括：将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞；用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入il-2、ifn-γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养；体外扩增培养，离心收集得到的cik细胞。一种由上述培养方法制得的cik细胞制剂。与现有技术相比，本发明的有益效果例如包括：本发明提供的这种cik细胞的培养方法，通过将从人体外周血中分离出单个核细胞，并使其在体外与细胞因子il-2和ifn-γ共同孵育培养一段时间后获得的一群异质性细胞。这些异质性细胞经过体外扩增培养后，具有较高杀伤活性的细胞数量明显增多(培养至12天时，cik细胞的数量为13.07±1.37)×109个，且细胞活性率>95％)，回输到肿瘤患者体内后能够有效增强其自身的免疫力，增大抗肿瘤效应，改善肿瘤患者的生活质量。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实验例中两组患者治疗前后的karnofsky评分的比较，其中，**p<0.01vscik治疗前。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本实施方式提供一种高细胞毒性的cik细胞的培养方法，其包括以下步骤：步骤s1:将抗凝外周血离心，移除血浆层后与淋巴细胞分离液混合，分离出外周血单个核细胞。其中，抗凝外周血可以为肝素抗凝血，不包括edta抗凝血。将抗凝外周血离心后，上层为血浆层，下层血沉棕黄层(buffycoat)+红细胞层。其中，血浆层用于制备自体血浆，血沉棕黄层(buffycoat)+红细胞层用于制备外周血单个核细胞。进一步地，自体血浆的制备方法包括：将血浆层于50～60℃下放置25～35min后，再于0～10℃下静置10～20min后，离心取上清。较为优选地为，将血浆层于54～58℃下放置28～32min后，再于2～6℃下静置18～22min后，离心取上清，即得。步骤s2:用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度，并加入il-2、ifn-γ和自体血浆，置于培养瓶中进行培养。进一步地，外周血单个核细胞的细胞浓度为0.5×105～0.5×107个/ml。进一步地，培养瓶中，il-2的终浓度为800～1200iu/ml，ifn-γ的终浓度为800～1200iu/ml。进一步地，培养瓶中，自体血浆的终浓度为0.5～1.5％。较为优选地，培养体系包括：用淋巴细胞培养基调整外周血单个核细胞的细胞浓度为0.5×105～0.5×107个/ml(共30ml)，并加入60μl的ifn-γ(终浓度为800～1200iu/ml)、60μl的il-2(终浓度为800～1200iu/ml)，600μl的自体血浆(终浓度为1％)。进一步地，淋巴细胞培养基为gt-t551h3培养基。进一步地，培养瓶的培养条件为35～40℃、co2培养箱。步骤s3:体外扩增培养，离心收集得到的cik细胞。本实施方式还提供一种由上述培养方法制得的cik细胞制剂。进一步地，该cik细胞制剂还包括人血清白蛋白、生理盐水。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：实施例1本实施例提供一种高细胞毒性的cik细胞制剂，其培养方法包括：(1).采血：经传递窗接过外周血100ml(不可edta抗凝)，酒精喷后拿进安全柜，将采集的外周血混匀后加入50ml的无菌离心管中，室温，700g下离心沉降20min，上层a为血浆层(约占50％)，下层b为buffycoat+红细胞层。(2).自体血浆制备：将血浆层置于50ml新管中，于56℃下放置30min，并于4℃下静置15min；随后，在800g、4℃离心25min，取出上清液置于50ml的离心管中作为自体血浆备用。(3).外周血单个核细胞分离：a.将下层b(即buffycoat+红细胞层)与d-pbs混合均匀，总体积为50ml，得到稀释液；b.吸取25ml的a步骤中的稀释液，贴管壁加入12.5ml的淋巴细胞分离液中，于室温、2000rpm下离心20min；c.离心结束后，加入d-pbs10ml于50ml离心管中，小心吸取白膜层至50ml离心管中，pbs补齐体积至3倍以上，室温下2000rpm离心10分钟。d.离心结束后，弃上清，震荡使细胞重悬，加入10mlpbs充分混匀后再加pbs至40ml，混匀后于室温下1000rpm离心10分钟。e.离心结束后，弃上清，震荡使细胞重悬，加入20mlgt-t551h3培养基混匀，再加入gt-t551h3至40ml混匀，吸取50μl细胞悬液于1.5mlep管中，细胞计数。f.室温下，1000rpm离心10分钟，弃上清后重悬细胞，加入30mlgt-t551h3充分混匀后，吸入包被瓶底。加入30mlgt-t551h3培养基至细胞终浓度约0.5×106/ml，再加入60μlil-2(终浓度1000iu/ml)、60μlifn-γ(终浓度1000iu/ml)、600μl自体血浆(终浓度1％)，混匀后吸入培养瓶中，口部酒精消毒后置于37℃co2培养箱中扩增培养，自体血浆标记封口。(4)体外扩增培养，离心收集得到的cik细胞。实施例2本实施例提供一种高细胞毒性的cik细胞制剂，其培养方法与实施例1基本一致，不同之处在于体外扩增培养过程：(1).转袋：a.在培养第4天时，在显微镜下观察细胞形态、活力及有无污染情况；b.随后，收集培养瓶内的细胞悬液至离心管中，pbs稀释4倍计数。按细胞浓度维持1×106个/ml计算补液量、il-2和自体血浆量。c.将固定量的gt-t551h3培养基加入50ml离心管中，根据培养体系的总体积添加500单位/ml的il-2(v/2μl)和0.5％的自体血浆(10倍于il-2)，混匀。d.取gt-t610a培养袋，旋开长管后酒精棉球擦拭口部，与60ml注射器连接，将细胞悬液倒入转移装置中，转移至gt-t610a培养袋，然后向细胞悬液离心管中倒入剩余培养基，转入培养袋，最后倒入含细胞因子的培养基，关闭进样开关。封口后进行标记，酒精擦拭消毒后置于37℃co2培养箱中扩大培养。(2)补液分别于培养第6天和第7天时补液，并在显微镜下观察细胞形态、活力和有无污染情况。补液步骤为：充分混匀培养袋中的细胞悬液后，抽取0.5ml细胞悬液，pbs稀释5倍计数。根据细胞数量按细胞浓度维持1×106个/ml适量补充培养基。根据培养体系的总体积添加500单位/ml的il-2和0.5％的自体血浆，在培养基瓶或50ml离心管中配置培养基。(3)检测于培养第9天时，在显微镜下观察细胞形态、活力和有无污染情况，并取2ml细胞至2个无菌ep管中，分别做细菌培养和支原体抗体检测。(4)回输于培养第11天和第14天时，进行回输。a.取样放置24孔板，在显微镜下观察细胞形态、活力及有无污染。b.充分混匀培养袋中的细胞悬液，吸取0.5ml进行细胞计数，吸取适量细胞悬液至500ml离心管中(细胞总数应达到1～5×109个/ml回输),于室温下，2000rpm离心10min。离心结束后，弃上清，撕开生理盐水挂钩上，去掉一个盖，消毒后撕开输液器插入，放出液体重悬细胞，将两管合并于一管中于室温下，2000rpm离心10min。弃上清，抽取20ml0.9％的生理盐水重悬细胞，混匀，将收集的细胞缓慢注入100ml0.9％的生理盐水中，取5ml20％的人血蛋白加入到细胞悬液中，贴标签，得cik细胞制剂。c.剩余细胞补加gt-t551h3培养基，根据细胞数量按细胞浓度维持1×106个/ml适量补充培养基。根据培养体系的总体积添加500单位/ml的il-2和0.5％的自体血浆，置于37℃、co2培养箱中继续扩增培养。实验例cik细胞治疗效果评价：一、试验过程：筛选2014年7月-2015年12月期间于我院肿瘤科收治的62例肿瘤化疗患者。31例单纯接受化疗，纳入化疗组；其中男性22例、女性9例，平均年龄(58.5岁)。31例辅以cik治疗(实施例2提供的cik细胞制剂)纳入(化疗+cik)组；其中男性20例，女性11例，平均年龄(57.82岁)。经检查评估两组患者性别、年龄及肺癌组织学分型无明显差异；血象正常，心脏、肝、肾功能均可耐受化疗及生物治疗；生活质量(kps)评分均≥60分，预计生存期大于3个月。治疗方案经过医院伦理委员会批准，肿瘤患者签署知情同意书。二、试验结果：1.kps评分结果：两组患者经四个疗程治疗结束后分别进行kps评分，统计结果如图1所示，从图1可以看出，患者经化疗后其评分略有降低，生活质量不佳；而经cik治疗后，肿瘤患者的kps评分较治疗前相比明显升高，多数患者自述体力得到一定程度的恢复且食欲好(83.2±4.76vs72.8±4.58，p<0.01)，提示化疗后肿瘤患者辅以cik细胞治疗能够明显改善其生活质量。2.影像学评价结果：表1.两组患者治疗后客观缓解率和疾病控制率比较(n＝62)注：**p<0.01vs治疗前由表1可见，cik细胞治疗四个疗程后经影像学评价，单纯化疗组完全缓解为0例，7例部分缓解，14例稳定，dcr为67.7％；然而cik治疗组完全缓解0例，6例部分缓解，20例稳定，dcr为83.8％，较单纯化疗组相比，dcr明显升高且具体统计学差异(p<0.05)，由此提示cik细胞治疗能够有效控制化疗后肿瘤的生长，且多数接受cik治疗患者的疾病维持稳定。3.免疫指标评价结果：表2.cik联合化疗组31例患者治疗前后免疫指标变化的比较时间cd3+tcd4+tcd8+tcd3+cd56+细胞治疗前2.78±0.831.55±0.481.2±0.390.46±0.19治疗后3.53±0.98**2.04±0.58**1.36±0.420.65±0.23**注：**p<0.01vs治疗前表3.单纯化疗组31例患者治疗前后免疫指标变化的比较时间cd3+tcd4+tcd8+tcd3+cd56+细胞治疗前2.71±11.54±0.491.23±0.540.38±0.19治疗后2.32±0.941.34±0.480.99±0.420.29±0.17对比表2和表3可知，cik联合化疗组在四个疗程后，其免疫指标明显多于治疗前，且高于单纯化疗组的各项指标。综上所述，采用本发明实施例2制备的cik细胞联合化疗，疗效显著，能够明显改善肿瘤患者的生活质量，提高其自身免疫力，且副作用小，患者的耐受性强。尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12