本发明属于工业生物技术领域，具体涉及一种表面固定化酵母发酵技术。
背景技术：
随着自然资源的匮乏和环境问题的日渐突出，生物发酵技术的地位也越来越重要，近些年来也取得了迅猛发展。然而传统液态深层发酵依然存在天然缺陷，如由于机械性损伤及不适的液体环境，细胞生长的稳定性较差，易发生显著的细胞衰亡和自溶现象以及时空效率低等，致使生物发酵技术的成熟度难以与化学催化剂相比拟，这也是生物制造目前难以替代化学制造的主要瓶颈之一。
针对传统发酵过程中的不足，目前很多学者研究了固定化酵母对乙醇发酵的作用。固定化细胞技术本质是用物理或化学的手段将游离细胞定位于限定的空间区域，使其保持催化活性，并可反复使用，减少细胞流失。固定化细胞具有发酵周期短、耐受性强以及转化率高等优点。传统的固定化方法主要采用凝胶包埋技术，即用角叉莱胶、卡拉胶、海藻酸钙、海藻酸钠等对细胞进行固定发酵。虽然此类包埋载体具有成型方便及固定化密度高等优点，但其机械强度低，传质效果差。之前我们申请了表面固定化酵母发酵技术(如专利号zl201210538977.x)，即将特殊处理的纤维材料附着于支撑骨架，并填充到生物反应器中，然后将酵母细胞固定于生物反应器中的纤维材料上，从而实现固定化酵母发酵的目的。该技术所用载体可长期反复利用，发酵效率明显提高，稳定性很强，但这种方法存在一定的缺陷，即前期投入成本较高，维修相对较困难。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种表面固定化酵母发酵技术，以解决现有技术存在的效果不佳等问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种表面固定化酵母发酵技术，它包括如下步骤：
(1)将吸附介质固定于球型网格中，并将球型网格填充于发酵罐中；
(2)向步骤(1)中所述的发酵罐中泵入种子液，培养并循环固定；
(3)种子固定结束后，排出种子醪，泵入发酵液，发酵结束后更换新的发酵液。
步骤(1)中，所述的吸附介质为纤维，聚氨酯泡沫，木渣和秸秆中的任意一种或几种的组合。
其中，所述的所述的吸附介质还可预先经过如下方式的处理：
将吸附介质先后置于浓度为1～100g/l的表面改性剂(如聚醚酰亚胺、二乙三胺、二甲胺基丙胺)水溶液中和1～100g/l的交联剂水溶液中均浸泡1～40小时(温度均为常温)，再将纤维材料置于去离子水中充分漂洗后烘干。
步骤(1)中，所述的球型网格由耐高温耐腐蚀耐酸碱的材质制成，优选聚四氟乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯。
步骤(1)中，所述的吸附介质为圆形片状，直径为6～12cm；所述的球型网格直径为15～25cm。
步骤(1)中，一个球型网格中装有2～4个吸附介质。
步骤(1)中，所述的发酵罐的高径比为1.2～2.2：1，片状吸附介质填充量为50～200cm2/l。
步骤(2)中，所述的种子液的配方为人工配置培养基，玉米、木薯或陈化粮的糖化液(压滤后清液)和糖蜜中的一种，酵母数量为2.0～3.5亿个/ml；
其中，
所述的人工配置培养基的配方为葡萄糖20～100g/l，蛋白胨5～20g/l，酵母膏5～20g/l，硫酸镁0.1～1g/l，ph4.0～5.0；
所述的玉米、木薯或陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5～3：1；
所述的糖蜜的初始总糖为20～180g/l；
其中，所述的培养并循环固定是指30～35℃下循环培养(罐底部出来，罐上端入料)，循环量为0.5～4bv(1bv指的是1小时循环1遍，即1v/v/h)。
步骤(3)中，所述的发酵液为人工配置培养基，玉米、木薯或陈化粮的糖化液(压滤后清液)，秸秆或纤维素的水解液和糖蜜中的任意一种或几种的组合；
其中，
所述的人工配置培养基的配方为葡萄糖20～100g/l，蛋白胨5～20g/l，酵母膏5～20g/l，硫酸镁0.1～1g/l，ph4.0～5.0；
所述的玉米、木薯或陈化粮的糖化液中，料水质量比为2.5～3：1；
所述的秸秆或纤维素的水解液中，料液质量比为1：2～3，ph为4.5～5.2；水解条件为转速100～250r/min，温度45～60℃，酶解1～2.5小时；
所述的糖蜜的初始总糖为20～180g/l。
其中，种子液体积占一次发酵所用的发酵液的体积的5～20％。
步骤(3)中，所述的种子固定结束是指酵母菌体吸附量达到1.0～3.0亿个/ml，所述的发酵结束是指发酵罐内还原糖的浓度降低至0.5～4g/l。
有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优势：
1、本发明采用的固定化技术所用材料成本低、无毒性；物化性质稳定，可在酸性条件下长达一年不降解，吸附介质表面积大，吸附效果好；而且，死细胞可自行脱落，活细胞能够实现自身增殖，始终维持很高的生产效率；
2、本发明采用的固定化方式载体间空隙大，相比其他吸附或交联法传质效果较好，发酵速度快，底物转化率高；
3、吸附载体投入成本低，填充和取出简单，便于检修，适于工业化应用。
附图说明
图1a为吸附材料的俯视图；
图1b为固定吸附材料的支架的俯视图；
图2a为球型网格的示意图；
图2b为球型网格的内部结构正视图；
图中尺寸的单位为cm。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1以合成培养基为发酵原料采用竹纤维固定化酵母制备燃料乙醇
首先，将剪成直径15cm的竹纤维(厚度0.15cm)放入聚四氟乙烯(ptfe)制成的如图1所示直径20cm球形网格中，制备成固定化载体(图2)；然后将固定化介质以150cm2/l的填充量放入高径比2:1的15l反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为30l/h循环固定36h。直至菌体吸附浓度2.0亿个/ml。然后排出废液。再流加发酵培养基(葡萄糖浓度为220g/l)，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为33℃，发酵液ph4.5，流速为30l/h。5批平均发酵周期为20h，反应浓度达到103.5g/l，比游离发酵缩短了8h。乙醇产率达到5.2gl-1h-1，平均转化率92.1％，分别比游离发酵提高20％和6.5％，比海藻酸钠固定化载体发酵提高35％和3.5％。
实施例2以木薯液化醪培养基为发酵原料采用棉纤维固定化酵母制备燃料乙醇
首先，将剪成直径20cm的棉纤维放入聚乙烯制成的直径25cm球形网格中，制备成固定化介质；然后将固定化介质以120cm2/l的填充量放入高径比1.8:1的15l反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为15l/h循环固定48h。直至菌体吸附浓度2.5亿个/ml。然后制备木薯液化醪：料液比1:2.5，加液化酶(15u/g木薯干重)85℃液化2小时，冷却后排出固定化种子废液。再流加木薯液化醪，并加入糖化酶(180u/g木薯干重)，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为35℃，发酵液ph4.5，流速为15l/h。10批平均发酵周期为24h，反应浓度达到102.8g/l，比游离发酵缩短了4h。乙醇产率达到4.28gl-1h-1，平均转化率91.8％，分别比秸秆吸附载体提高了20％和3％。
实施例3以高浓度木薯液化醪培养基为发酵原料采用棉纤维固定化酵母制备燃料乙醇
首先，将剪成直径8cm的棉纤维放入聚氟乙烯制成的直径12cm球形网格中，制备成固定化介质；然后将固定化介质以160cm2/l的填充量放入高径比1.8:1的50l反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为30l/h循环固定48h。直至菌体吸附浓度2.0亿个/ml。然后制备木薯液化醪：料液比1:2，加液化酶(18u/g木薯干重)90℃液化1.5小时，冷却后排出固定化种子废液。再流加木薯液化醪，并加入糖化酶(200u/g木薯干重)，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为36℃，发酵液ph4.2，流速为30l/h。6批平均发酵周期为44h(初始总糖263g/l)，反应浓度达到125.2g/l，比游离发酵缩短了6h。乙醇产率达到2.85gl-1h-1，平均转化率93.1％，相同发酵条件下，比我们之前专利(专利号zl201210538977.x)所用的固定化方法(同样的吸附材料附着在钢丝网表面)得率提高了2.5％，比其所用的支撑材料成本降低了80％以上，且取放更方便，更容易应用于生产。
实施例4以玉米液化醪培养基为发酵原料采用化学修饰的棉纤维固定化酵母制备燃料乙醇
首先，将棉纤维经戊二醛化学交联后，剪成直径15cm的尺寸，放入聚四氟乙烯制成的直径20cm球形网格中，制备成固定化介质；然后将固定化介质以120cm2/l的填充量放入高径比1.6:1的50l反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为45l/h循环固定48h。直至菌体吸附浓度2.2亿个/ml。然后制备玉米液化醪：料液比1:2.3，加液化酶(15u/g木薯干重)86℃液化1.5小时，冷却后排出固定化种子废液。再流加木薯液化醪，并加入糖化酶(200u/g木薯干重)，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为34℃，发酵液ph4.2，流速为45l/h。8批平均发酵周期为20h(初始总糖216.7g/l)，反应浓度达到102.5g/l，比游离发酵缩短了6h。乙醇产率达到5.13gl-1h-1，平均转化率92.6％，比游离发酵提高6.0％。
实施例5以糖蜜为发酵原料采用活性炭纤维固定化酵母制备燃料乙醇
首先，将活性碳纤维剪成直径12cm的尺寸，放入聚四氟乙烯制成的直径16cm球形网格中，制备成固定化介质；然后将固定化介质以200cm2/l的填充量放入高径比1.5:1的50l反应器中。然后将培养好的菌种加到发酵罐中，以流速为60l/h循环固定48h。直至菌体吸附浓度2.0亿个/ml。然后制备糖蜜培养基：糖蜜与水1:1.2稀释，调酸至3.0，加热酸化1小时，静置除去沉淀，冷却后排出固定化种子废液。再流加糖蜜，装液量75％，进行循环发酵，其中温度为35℃，发酵液ph4.0，流速为60l/h。20批平均发酵周期为28h(初始总糖230g/l)，反应浓度达到108.3g/l，比游离发酵缩短了6h。乙醇产率达到3.87gl-1h-1，平均转化率92.1％，比游离发酵提高3.8％。