本发明涉及酶工程技术领域，尤其是涉及一种β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶通过溶胶凝胶法实现双酶共固定化生产低聚乳果糖的新方法。
背景技术：
β-呋喃果糖苷酶(ec3.2.1.26)是一种广泛存在于植物和微生物中的糖苷酶，既具有水解作用，能催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖，又具有转糖基作用，可广泛用于合成功能性低聚糖、食品添加剂、糖苷类物质的修饰与改性和其它的生物活性物质。但是不同来源的β-呋喃果糖苷酶性质不同，转糖基的能力和受体特异性也不同，节杆菌产β-呋喃果糖苷酶主要用于催化合成低聚乳果糖，能以蔗糖和乳糖为原料，将蔗糖水解产生的果糖基转移至乳糖还原性末端的c1位羟基上，生成半乳糖基蔗糖即低聚乳果糖。
而由于β-呋喃果糖苷酶来源于微生物发酵，酶制剂存在大量杂质、酶的催化活性低、稳定性差、酶的利用率低，反应之后游离酶不易与产物分离，反应产物纯化成本高，难以实现工业化大生产。并且在合成低聚乳果糖的过程中，β-呋喃果糖苷酶也能催化蔗糖和低聚乳果糖水解产生副产物葡萄糖，葡萄糖会非竞争性抑制果糖苷酶转果糖基活性，使低聚乳果糖得率降低，而葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖转化为葡萄糖酸，消除底物抑制，提高低聚乳果糖转化率。
酶的固定化是人们针对游离酶的缺点发展起来的新技术。与游离的酶相比，固定化酶具有很多优点，酶在固定化过程中可能发生一些结构变化，从而在一定程度上改变其性质和活性。而另一方面，通过合适的方法固定酶可使得酶结构刚性化在一定程度上能防止酶变性，并最终提高稳定性和活性等性能，实现酶的重复利用，并且固定化酶还能实现酶与产物的分离，降低产物分离纯化成本。
由于低聚糖的快速发展，β-呋喃果糖苷酶的固定化逐渐成为研究的热点，但由于酶本身稳定性差，不易包埋等特点，关于果糖苷酶固定的文献并不多，研究最为广泛的是壳聚糖和海藻酸钠包埋法，但是这些材料机械强度不高，固定化酶活性保留率都不高，基本在60％左右，并且酶在多次使用后活性下降明显。
溶胶凝胶法是将一定量的硅酯、水、催化剂和溶剂等物质混合，振摇，通过水解、缩合(包括聚缩合)、溶胶、老化、凝胶而固化的方法。溶胶凝胶法以其温和的反应条件、广泛的适用性以及较高的生物分子结构和酶活保留率等突出优点成为固定化酶的有效方法。由于二氧化硅比有机聚合物材料更具有化学和热稳定性，所以应用得较为广泛。但是普通的溶胶凝胶法对于β-呋喃果糖苷酶的固定会使得包埋在凝胶里的酶的活性释放受到抑制，表现出的酶活明显降低，更加无法与β-呋喃果糖苷酶同时固定其他酶，使得其应用受到了一定限制。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶通过溶胶凝胶法实现双酶共固定化生产低聚乳果糖的方法。与传统的固定化β-呋喃果糖苷酶生产低聚乳果糖相比较，本发明首次采用溶胶凝胶法固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶以提高酶的稳定性，得到较高的酶活回收率，提高低聚乳果糖得率，与传统方法相比操作简单，条件温和，为一种环境友好型的绿色方法。
本发明的技术方案如下：
一种固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶的方法，包括如下步骤：
(1)β-呋喃果糖苷酶的生产；
(2)β-呋喃果糖苷酶的分离纯化；
(3)纯化后的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶溶液在硅烷偶联剂的存在下通过溶胶凝胶法固定在凝胶上。
所述的固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶的方法的具体步骤为：
(1)β-呋喃果糖苷酶的生产方法：
先将节杆菌属arthrobactersp.10137活化：将节杆菌接入活化培养基中，于30℃下培养24h，得到活化的菌种；所述活化培养基为葡萄糖2％；酵母膏0.15％；硫酸镁0.01％；磷酸二氢钾0.2％；以及磷酸氢二铵0.6％，以上单位均为w/v；ph为7.0-7.2；
之后进行种子培养：吸取1ml活化后的菌种至装有100ml种子培养基的250ml锥形瓶中；所述种子培养基为葡萄糖2％；酵母膏0.15％；蛋白胨0.3％；硫酸镁0.01％；磷酸二氢钾0.2％；以及磷酸氢二铵0.6％，以上单位均为w/v，ph为7.0-7.2，于摇床中30℃下培养24h，摇速为125r/min；
然后进行发酵培养：将种子培养液按2％～4％的接种量接入装有100ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养24～48h，摇速为125r/min；所述发酵培养基为蔗糖4％；酵母膏1.2％；蛋白胨0.8％；硫酸镁0.2％；磷酸二氢钾0.2％；磷酸氢二铵0.4％，以上单位均为w/v；ph为7.0-7.2；
最后将发酵完的培养液4000r/min离心20min，取出上清液即为粗酶液，于4℃下冷藏备用；
(2)β-呋喃果糖苷酶的分离纯化方法：
采用饱和硫酸铵分级盐析法，首先在正在搅拌的酶液中缓慢加入研磨好的固体硫酸铵粉末至30％饱和度，充分搅拌30～60min，然后放4℃冰箱静置2～4h，取出上清液，收集沉淀；
在取出的上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度，取出上清液，收集沉淀；
继续在取出的上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，取出上清，收集沉淀，重复以上步骤，加硫酸铵至60％，70％饱和度，最终至80％饱和度，取出上清，收集沉淀，加入缓冲液溶解沉淀；
将盐析所得的酶液加入透析袋中，在缓冲液ph6.5的环境下透析，透析液每隔8h换一次，得到纯化好的酶液；
(3)溶胶凝胶法固定纯化后的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶的方法：
纯化后的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶在搅拌状态下加入4％w/v的10mlpva溶液、浓度为1mol/l的5mlnaf溶液及10ml水，搅拌30min～60min得均匀溶液，然后缓慢加入3～5ml正辛基三乙氧基硅烷即otes及6～20ml正硅酸四乙酯即teos溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤，得到固定好双酶的凝胶，加缓冲液形成凝胶液进行保存。
优选的，步骤(3)中所述纯化后的β-呋喃果糖苷酶浓度为0.5～3.5mg/ml。
优选的，步骤(3)中所述加入的纯化后的β-呋喃果糖苷酶体积为10～40ml。
优选的，步骤(3)中所述葡萄糖氧化酶浓度为0.5～2.5mg/ml。
优选的，步骤(3)中所述葡萄糖氧化酶加入的体积为10～40ml。
优选的，步骤(3)中所述纯化后的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶的体积比为1:3～3:1。
优选的，步骤(3)中所述otes和teos的体积比为1:2～1:4。
优选的，步骤(3)中所述节杆菌购自中国工业微生物保藏中心，保藏编号是cicc10137。
本申请人还提供了所述的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶固定后生产低聚乳果糖的方法：取0.5ml底物溶液，加入0.5～4.5g固定好双酶的凝胶液，在ph6.5的条件下，在35～40℃下反应4～10h，然后离心，取出上清液，即为反应后的溶液；所述底物溶液包括20％蔗糖和20％乳糖，单位为w/v。
本发明有益的技术效果在于：
本发明克服了传统固定方法操作复杂、成本高、固定化效率不高、酶活回收率低、机械强度低、操作稳定性不高的缺点，提供的β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶固定化的方法酶活回收率高且稳定性好。本发明中主要通过氟化钠作为引发剂，正辛基三乙氧基硅烷和正硅酸四乙酯作为硅烷前驱体，以水为溶剂在液相下将原料均匀混合，进行一系列的水解、缩合反应，在溶液中形成稳定的透明溶胶体系，经过陈化，胶粒缓慢聚合，不断形成长链，形成凝胶网络，将酶包裹在里面，最后得到固定好β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶的凝胶。
本发明制备出的固定化酶便于回收利用。溶胶凝胶法为固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶提供了新途径，是一种步骤简单、环境友好型的绿色方法。
本发明制备的固定化双酶与游离酶相比在酸性环境下的相对酶活要高的多，固定化双酶比游离酶更耐受酸性环境，具有更宽泛的ph值耐受性。在ph4.0的环境下，游离酶保留了54.06％，而固定化酶保留有85.38％的酶活。
本发明制备的固定化双酶的最适温度与游离酶相比提高了5℃，从35℃提高到40℃，当反应温度提高到55℃时，游离酶几乎没有酶活，而固定化双酶仍保留有70.40％的酶活。
本发明制备的固定化双酶与游离酶相比具有良好的热稳定性。游离酶在40℃及以上温度下保温30min即失去活性，热稳定性极差，半衰期短，操作稳定性差，无法实现重复使用。而固定化酶的最适反应温度为40℃，在60℃下保温30min仍保留有51.85％的酶活。
本发明制备的固定化酶回收利用步骤简单，反应结束后离心取出上清液，加入新的反应液在沉淀里即可实现酶的回收利用；酶活回收率高，酶活回收率达到85.39％；且重复使用稳定性好，重复使用8次后的酶活力保留达82％。
本方法操作简单，成本低廉，制备的固定化双酶在连续化生产低聚乳果糖和提高低聚乳果糖产率等领域具有广泛应用前景。
附图说明
图1为溶胶凝胶法固定β-呋喃果糖苷酶和葡萄糖氧化酶双酶的工艺流程图。
图2为实施例3制备的固定化酶的重复使用性。
具体实施方式
下面结合附图1表示的方法和具体实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1：
先将arthrobactersp.10137菌种活化，将保藏的节杆菌接入活化培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)；ph7.0-7.2)中，于30℃下培养24h，得到活化的菌种。之后进行种子培养，吸取1ml活化后的菌种至装有100ml种子培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；蛋白胨0.3％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养24h，摇速为125r/min。然后进行发酵培养，将种子培养液按2％的接种量接入装有100ml发酵培养基(蔗糖4％(w/v)；酵母膏1.2％(w/v)：蛋白胨0.8％(w/v)；硫酸镁0.2％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.4％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养48h，摇速为125r/min。最后将发酵完的培养液4000r/min离心20min，取出上清液即为粗酶液，于4℃下冷藏备用。
采用饱和硫酸铵分级盐析法，首先在正在搅拌的酶液中缓慢加入研磨好的固体硫酸铵粉末至30％饱和度，充分搅拌30min，然后放4℃冰箱静置2h，取出上清液，收集沉淀。在取出的上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度，取出上清液，收集沉淀。继续在取出的上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，取出上清，收集沉淀，重复以上步骤，加硫酸铵至60％，70％饱和度，最终至80％饱和度，取出上清，收集沉淀，加入缓冲液溶解沉淀。将盐析所得的酶液加入透析袋中，在缓冲液ph6.5的环境下透析，透析液每隔8h换一次，得到纯化好的酶液。
纯化后的β-呋喃果糖苷酶10ml(1mg/ml)和葡萄糖氧化酶20ml(1mg/ml，ph5.0)搅拌状态下加入10mlpva溶液(4％，w/v)，5mlnaf溶液(1mol/l)及10ml水，搅拌30min得均匀溶液，然后缓慢加入4ml正辛基三乙氧基硅烷(otes)及10ml正硅酸四乙酯(teos)溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤3次。
实施例2：
先将arthrobactersp.10137菌种活化，将保藏的节杆菌接入活化培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)；ph7.0-7.2)中，于30℃下培养24h，得到活化的菌种。之后进行种子培养，吸取1ml活化后的菌种至装有100ml种子培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；蛋白胨0.3％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养24h，摇速为125r/min。然后进行发酵培养，将种子培养液按3％的接种量接入装有100ml发酵培养基(蔗糖4％(w/v)；酵母膏1.2％(w/v)：蛋白胨0.8％(w/v)；硫酸镁0.2％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.4％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养36h，摇速为125r/min。最后将发酵完的培养液4000r/min离心20min，取出上清液即为粗酶液，于4℃下冷藏备用。
采用饱和硫酸铵分级盐析法，首先在正在搅拌的酶液中缓慢加入研磨好的固体硫酸铵粉末至30％饱和度，充分搅拌60min，然后放4℃冰箱静置3h，取出上清液，收集沉淀。在取出的上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度，取出上清液，收集沉淀。继续在取出的上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，取出上清，收集沉淀，重复以上步骤，加硫酸铵至60％，70％饱和度，最终至80％饱和度，取出上清，收集沉淀，加入缓冲液溶解沉淀。将盐析所得的酶液加入透析袋中，在缓冲液ph6.5的环境下透析，透析液每隔8h换一次，得到纯化好的酶液。
纯化后的β-呋喃果糖苷酶30ml(2.5mg/ml)和葡萄糖氧化酶15ml(2mg/ml，ph5.0)搅拌状态下加入10mlpva溶液(4％，w/v)，5mlnaf溶液(1mol/l)及10ml水，搅拌60min得均匀溶液，然后缓慢加入5ml正辛基三乙氧基硅烷(otes)及15ml正硅酸四乙酯(teos)溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤3次。
实施例3：
先将arthrobactersp.10137菌种活化，将保藏的节杆菌接入活化培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)；ph7.0-7.2)中，于30℃下培养24h，得到活化的菌种。之后进行种子培养，吸取1ml活化后的菌种至装有100ml种子培养基(葡萄糖2％(w/v)；酵母膏0.15％(w/v)；蛋白胨0.3％(w/v)；硫酸镁0.01％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.6％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养24h，摇速为125r/min。然后进行发酵培养，将种子培养液按4％的接种量接入装有100ml发酵培养基(蔗糖4％(w/v)；酵母膏1.2％(w/v)：蛋白胨0.8％(w/v)；硫酸镁0.2％(w/v)；磷酸二氢钾0.2％(w/v)；磷酸氢二铵0.4％(w/v)，ph7.0-7.2)的250ml锥形瓶中，于摇床中30℃下培养48h，摇速为125r/min。最后将发酵完的培养液4000r/min离心20min，取出上清液即为粗酶液，于4℃下冷藏备用。
采用饱和硫酸铵分级盐析法，首先在正在搅拌的酶液中缓慢加入研磨好的固体硫酸铵粉末至30％饱和度，充分搅拌60min，然后放4℃冰箱静置4h，取出上清液，收集沉淀。在取出的上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至40％饱和度，取出上清液，收集沉淀。继续在取出的上清液中加入硫酸铵至50％饱和度，取出上清，收集沉淀，重复以上步骤，加硫酸铵至60％，70％饱和度，最终至80％饱和度，取出上清，收集沉淀，加入缓冲液溶解沉淀。将盐析所得的酶液加入透析袋中，在缓冲液ph6.5的环境下透析，透析液每隔8h换一次，得到纯化好的酶液。
纯化后的β-呋喃果糖苷酶40ml(2mg/ml)和葡萄糖氧化酶40ml(1.5mg/ml，ph5.0)搅拌状态下加入10mlpva溶液(4％，w/v)，5mlnaf溶液(1mol/l)及10ml水，搅拌30min得均匀溶液，然后缓慢加入3ml正辛基三乙氧基硅烷(otes)及8ml正硅酸四乙酯(teos)溶液，继续搅拌过夜，离心倒出上清液，用水洗涤3次。
实施例4
取0.5ml底物溶液(20％(w/v)蔗糖+20％(w/v)乳糖)，加入实施例3制备得到的0.5～4.5ml固定好双酶的凝胶液，在ph6.5的条件下，在35℃下反应8h，10000r/min离心10min，取出上清液，即为反应后的溶液，检测低聚乳果糖含量。以加入0.5～4.5ml的固定化β-呋喃果糖苷酶单酶为对照，计算低聚乳果糖得率。
取0.5ml底物溶液(20％(w/v)蔗糖+20％(w/v)乳糖)，加入实施例3制备得到的0.5～4.5ml固定好双酶的凝胶液，在ph6.5的条件下，在35℃下反应8h，10000r/min离心10min，取出上清液，即为反应后的溶液，检测低聚乳果糖含量，在沉淀中继续加入底物溶液进行反应，然后再弃去反应液，重复反应8批，实现固定化双酶的重复使用，得到图2，固定化双酶的重复使用性。
结果显示，与固定化β-呋喃果糖苷酶单酶相比，加入固定化双酶的反应液中低聚乳果糖得率提高了15％。并且固定化双酶具有很好的重复使用性，在使用8次后，还保留了82％的酶活力，操作稳定性得到了大大的提高。固定化双酶的酶分子结构较稳定，因此具有良好的稳定性，能够重复多次使用，并且机械强度高，为后面做连续化生产的反应柱奠定了基础，大大提高了经济效益和低聚乳果糖的得率。