本发明涉及一种环状rnacirc-erbb2及其检测试剂与应用，具体涉及一种环状rnacirc-erbb2、其检测引物和探针以及该环状rnacirc-erbb2在乳腺癌诊断中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
环状rna(circrna)是一类在生物体内存在的闭合的环状rna分子，具有多种生物学特性，而且是客观大量存在的。环状rna由基因组dna转录加工后，反向拼接产生的一类新颖的核酸分子。对于环化rna的具体功能机制尚未明确，但在生物体内可以多层次调控基因的表达，比如：环状rna可以通过海绵作用吸附mirna，转录后调控基因表达；环状rna可以和rna结合蛋白作用调控基因转录；环状rna可以和基因组dna结合调控rna的剪接；另外环状rna可以直接作为模板翻译蛋白质发挥重要的生物学作用。
erbb2基因又叫her2基因，是一个著名的癌基因，在多种肿瘤细胞及临床病理组织中呈现高表达。人类的erbb2基因定位于17号染色体长臂上，整个转录本基因组跨越28685bp碱基对，全长转录本包含31个外显子。
然而，现有技术暂无关于环状rnacirc-erbb2的研究。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种环状rnacirc-erbb2及其检测试剂与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种环状rnacirc-erbb2，所述环状rnacirc-erbb2对应的cdna序列如seqidno:1所示，所述环状rnacirc-erbb2由erbb2母基因的第3,4,5,6和7外显子反向拼接环化产生。
本发明的环状rnacirc-erbb2是申请人检测环状rna数据库circbase及设计反向扩增pcr引物，经过大量研究，在乳腺癌细胞系bt474细胞中识别鉴定的一个新型环状rna分子。环状rnacirc-erbb2是由erbb2基因的第3和7外显子首位相接连接而成的环状rna分子，申请人将其命名为circ-erbb2，成熟circ-erbb2序列的长度为676nt。
第二方面，本发明提供了上述环状rnacirc-erbb2作为分子标志物在制备用于诊断乳腺癌的试剂盒中的应用。
经过研究，申请人发现，本发明的环状rnacirc-erbb2分子在乳腺癌细胞高表达，由此本发明的环状rnacirc-erbb2可作为分子标志物用于诊断乳腺癌。并且，本发明环状rnacirc-erbb2具有闭合的环状结构，不容易受核酸外切酶攻击，在生物体内非常稳定，是理想的分子诊断标志物。
第三方面，本发明提供了上述环状rnacirc-erbb2的检测试剂在制备用于诊断乳腺癌的试剂盒中的应用。
第四方面，本发明提供了上述环状rnacirc-erbb2的检测引物，所述引物的核苷酸序列如seqidno:5和seqidno:6所示。seqidno:5和seqidno:6所示引物是用于扩增环状rnacirc-erbb2对应的cdna的pcr引物。
第五方面，本发明提供了上述环状rnacirc-erbb2的检测探针，所探针的核苷酸序列如seqidno:4所示；所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。所述探针是taqman探针，该探针能很好的检测生物体内的circ-erbb2表达情况，可以为疾病的早期诊断和分类提供新的基因检测方案。
第六方面，本发明提供了上述引物和/或上述探针在制备用于检测环状rnacirc-erbb2或诊断乳腺癌的试剂盒中的应用，所述环状rnacirc-erbb2对应的cdna序列如seqidno:1所示，所述环状rnacirc-erbb2由erbb2母基因的第3,4,5,6和7外显子反向拼接环化产生。第七方面，本发明提供了用于检测环状rnacirc-erbb2或诊断乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物和/或上述探针，所述环状rnacirc-erbb2对应的cdna序列如seqidno:1所示，所述环状rnacirc-erbb2由erbb2母基因的第3,4,5,6和7外显子反向拼接环化产生。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括rna提取试剂、逆转录反应体系和rcr反应液。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括去基因组dna反应体系。
作为本发明所述试剂盒的更优选实施方式，所述rna提取试剂为trizol试剂。
本发明检测环状rnacirc-erbb2或诊断乳腺癌的方法包括以下步骤：(1)提取乳腺细胞中的总rna；(2)用dna酶除去提取的rna中残留的基因组dna；(3)将rna逆转录成cdna；(4)采用pcr引物和探针进行荧光定量pcr，检测环状rnacirc-erbb2分子在乳腺细胞中的表达情况。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种新的环状rna分子—环状rnacirc-erbb2，并以该环状rnacirc-erbb2作为分子标志物诊断乳腺癌。本发明还设计针对环状rnacirc-erbb2分子的荧光定量检测引物及taqman探针，通过该探针和引物申请人在多个乳腺癌细胞及正常乳腺细胞中检测到了circ-erbb2分子的表达情况。本发明的taqman探针检测环状rnacirc-erbb2的方法能很好的检测生物体内的circ-erbb2表达情况，可以为疾病的早期诊断和分类提供新的基因检测方案。
附图说明
图1为本发明环状rnacirc-erbb2的分子定位及形成模式图；
图2为本发明环状rnacirc-erbb2的dna测序验证环化接口峰图；
图3为本发明taqman探针荧光定量pcr检测环状rnacirc-erbb2在正常乳腺及乳腺癌细胞中表达的结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明环状rnacirc-erbb2的一种实施例，本实施例所述环状rnacirc-erbb2对应的cdna序列如seqidno:1所示，所述环状rnacirc-erbb2由erbb2母基因的第3,4,5,6和7五个外显子反向拼接环化产生，其成熟circ-erbb2序列的长度为676nt，环状rnacirc-erbb2的分子定位及形成模式图如图1所示。
实施例2
本实施例设计pcr扩增引物并识别鉴定实施例1所述环状rnacirc-erbb2在乳腺癌细胞中的客观存在。本实施例识别鉴定的方法包括以下步骤：1.trizol方法提取乳腺癌细胞中的总rna；2.用dna酶除去提取的rna中残留的基因组dna：3.将rna逆转录成cdna；4.设计反向扩增引物pcr扩增，pcr产物经核酸凝胶电泳后，割胶回收目标条带，然后经过sanger法dna测序验证环状rnacirc-erbb2的客观存在的接口。本实施例识别鉴定实施例1所述环状rnacirc-erbb2在乳腺细胞中客观存在的具体方法如下：
1.rna提取(trizol方法)
(1)细胞取100万个左右，加入1mltrizol；
(2)加入200μl氯仿，剧烈振荡10秒，室温静置10min；
(3)4℃下，12,000g离心10min，溶液分为三层，rna溶解在水相中，转移水相至另一个新的rnasefreeep管；
(4)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；
(5)4℃下，12,000g离心15min，离心后管底出现rna沉淀，弃去上清；
(6)加入1ml75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；
(7)室温晾干，加入20μldepc水溶解沉淀。
2.基因组dna去除
去除总rna中的基因组dna的残留，采用dna消化酶，具体反应体系和条件如下：
反应液总体积为10μl，如下组分组成：
反应液中于37℃消化40min后，85℃3min灭活dna消化酶。
3.rna逆转录成cdna
将rna逆转录成cdna反应体系和条件如下：
反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。
4.设计反向扩增pcr引物扩增circ-erbb2接口及侧翼序列dna测序验证
根据circbase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向pcr扩增引物，扩增circ-erbb2的接口及侧翼序列引物序列为：f1:5'ggtatacattcggcgccagc'(如seqidno:2所示)，r1:5'cacttggttgtgagcgatga3'(如seqidno:3所示)；引物扩增环状rnacirc-erbb2部分序列的大小为87bp；以bt474乳腺癌细胞系cdna为模板，pcr扩增环状rnacirc-erbb2的环化接口两侧的部分序列，经2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，pcr产物纯化后经dna测序验证，结果见图2。结果显示环状rnacirc-erbb2分子是由erbb2基因的第3和7外显子首位相接连接而成的环状rna分子。
实施例3
本实施例选用正常乳腺细胞系mcf10a以及乳腺癌细胞系mda-mb-231、mcf-7、bt474，采用荧光定量pcr扩增检测环状rnacirc-erbb分子在个细胞中的表达情况。
本实施例根据实施例1所述环状rnacirc-erbb2成熟序列设计设计荧光定量pcr的引物及taqman探针，引物序列为：f2:5'cttcaaccacagtggcatct3'(如seqidno:5所示)，r2:5'cctgcacctcctggatatca3'(如seqidno:6所示)；探针circ-erbb2-probe序列为：5'fam-cctggtcacctacaacacagaca-tamra3'(如seqidno:4所示)，扩增环状circ-erbb2环化接口区域序列的大小为150bp。
荧光定量pcr扩增检测环状rnacirc-erbb2分子在各细胞中表达情况的方法为：按照实施例2所述方法提取乳腺细胞中的总rna，并用dna酶除去提取的rna中残留的基因组dna，将rna逆转录成cdna；最后采用荧光定量pcr扩增进行检测，荧光定量pcr扩增检测环状rnacirc-erbb2分子在各细胞中的表达情况反应体系及反应条件如下：
荧光定量pcr反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环。
taqman探针荧光定量pcr检测环状rnacirc-erbb2在正常乳腺及乳腺癌细胞中的表达结果参见图3(图3中，p<0.001表示的是mcf10a细胞分别与mda-mb-231、mcf-7、bt474细胞比较的结果)，结果显示本方法检测环状rnacirc-erbb2分子在乳腺癌细胞高表达，环状rnacirc-erbb2在强阳性erbb2的乳腺癌细胞系bt474中表达最高。本发明的荧光定量pcr检测方法能够理想的检测环状rnacirc-erbb2在生物体中的表达情况。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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<110>广州永诺生物科技有限公司
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