本发明涉及生物技术生产领域，尤其是棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用。
背景技术：
目前工业化生产中多用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg诱导的表达质粒，需要在生产过程中添加iptg，价格昂贵，不利于工业化生产，并且iptg对菌体细胞生长影响严重同时发酵液中含有大量残余iptg，为后期产物的分离提取带来困难。尽管乳糖能够代谢iptg，但对于大多数棒状杆菌而言，乳糖不能够进入胞内，进一步限制了其在棒状杆菌中的应用。
肌醇，也称为环己六醇，属于维生素类，是合成细胞质膜中丰富的磷脂——磷脂酰肌醇所必需的，又是棒状杆菌如脂多糖和脂褐素单胞菌中更复杂的细胞糖脂的前体。此外，肌醇也是咪唑硫醇的结构单元，它是一种对棒状杆菌特异性的低分子量硫醇，对于保护活性氧的类似于真核生物和革兰氏阴性细菌中的谷胱甘肽的破坏作用是必需的。
5-氨基乙酰丙酸作为一种具有高附加值的氨基酸衍生物，在医疗和农业方面具有重要的应用价值与开发前景。近年来，作为一种安全、选择性和渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐得到了重视。目前，己经应用于多种癌症的诊断和治疗。在农业上，已经成为一种无公害的绿色农药，作为除草剂、植物生长调节剂等。同时，也是工业上一些有机物合成的中间体。化学合成法反应历程比较长，其反应历程中要不可避免的采取一些有毒且价格昂贵的原料，同时也不可避免的造成环境污染。此外，5-氨基乙酰丙酸的结构中含有活泼的氨基和羧基，合成过程中必须将其保护起来，这样就增加了反应的步骤、副产物和成本，导致得率不高。而目前生物法因生产效率低不能工业化生产需求。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供棒状杆菌诱导型启动子。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供含有上述棒状杆菌诱导型启动子的棒状杆菌诱导型表达质粒。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供利用上述棒状杆菌诱导型表达质粒得到的用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种棒状杆菌诱导型启动子piol，受肌醇诱导调控，其序列如序列表<400>1所示。
一种棒状杆菌诱导型表达质粒piol，含有上述棒状杆菌诱导型启动子。
优选的，上述棒状杆菌诱导型表达质粒piol，是将上述棒状杆菌诱导型启动子插入至质粒pxmj19的hpaⅰ和hindⅲ酶切位点得到的，其序列如序列表<400>2所示。
一种用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒piolhemal，在上述棒状杆菌诱导型表达质粒的bamhi和kpni酶切位点酶切位点插入谷氨酰-trna还原编码基因hema和谷氨酸-1-半醛-氨基转移酶heml，其序列如序列表<400>3所示，hema序列如序列表<400>4所示，heml序列如序列表<400>5所示。
上述用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒piolhemal的构建方法如下：
(1)克隆谷氨酰-trna还原编码基因hema和谷氨酸-1-半醛-氨基转移酶heml，hema序列如<400>4所示，heml序列如<400>5所示；
(2)分别将hema和heml转接至piol，piolhemal获得其序列如<400>3所示；
(3)将piolhemal转化至所需大肠杆菌escherichiacolidh5α。
一株5-氨基乙酰丙酸生产菌株，将上述棒状杆菌诱导型启动子连同其过表达的关键基因整合至宿主基因组，以及含有上述用于生产5-氨基乙酰丙酸的质粒。
优选的，上述5-氨基乙酰丙酸生产菌株，关键基因为柠檬酸合酶编码基因glta、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh、苏氨酸输出载体rhta以及转氢酶pntab中的一种或几种；其中，glta序列如序列表<400>6所示，gdh序列如序列表<400>7所示，rhta序列如序列表<400>8所示，pntab序列如序列表<400>9所示。
优选的，上述5-氨基乙酰丙酸生产菌株，是由下述方法构建得到的：
(1)构建含启动子piol的关键基因整合片段，关键基因包括柠檬酸合酶编码基因glta、谷氨酸脱氢酶编码基因gdh、苏氨酸输出载体rhta以及转氢酶pntab中的一种或几种。glta序列如<400>6所示，gdh序列如<400>7所示，rhta序列如<400>8所示，pntab序列如<400>9所示。
(2)将上述整合片段连接至pk18mobsacb获得重组质粒；
(3)将上述重组质粒转化至谷氨酸棒杆菌，获得关键基因过表达重组菌株；
(4)将piolhemal转化至上述重组菌株获得-氨基乙酰丙酸生产菌株。
一种应用上述菌株发酵法生产5-氨基乙酰丙酸的方法，利用所述5-氨基乙酰丙酸生产菌株生产5-氨基乙酰丙酸，具体步骤如下：
(1)种子培养：将权利要求5的菌株活化后，接种至装有1l种子培养基的5l发酵罐，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，溶氧维持在10-20％，通风量1-3m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；
(2)发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6l发酵培养基的10l发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速100-3000rpm，溶氧维持在10-20％，流加浓度为60-80％w/v的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％w/v，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，发酵周期30-48h；
(3)种子培养基成分为：蔗糖10-15g/l，玉米浆15-25ml/l，酵母粉1-6g/l，(nh4)2so41-4，kh2po40.5-1.5g/l，mgso40.1-0.5g/l，feso4·7h2o0.01-0.05g/l，mnso4·h2o0.010.05g/l，ph7.0，0.075mpa高压蒸汽灭菌15min；
(4)发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/l，玉米浆5-15ml/l，豆饼水解液5-15ml/l，(nh4)2so48-20g/l，生物素0.00004g/l，ph7.0-7.2，121℃高温灭菌20min。
本发明的有益效果是：
用本发明所述启动子构建的表达载体，通过肌醇诱导实现基因的可控表达，克服了现用诱导剂异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropylβ-d-thiogalactoside，iptg)对菌体细胞生长的抑制作用以及因其价格高昂和iptg于发酵液中残留致使分离提取困难造成的生产成本高等不足，同时具有稳定性等特性。利用该启动子整合于宿主基因组或将表达载体转化至宿主谷氨酸棒状杆菌构建获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株，将其应用于发酵法生产5-氨基乙酰丙酸中，其5-氨基乙酰丙酸产量达到24.2g/l，解决了发酵法效率低下的问题。
附图说明
图1肌醇诱导型表达质粒piol构建示意图。
图2重组质粒piolhemal酶切验证图谱，其中m为generuler1kb，1泳道为hema-heml基因片段，2泳道为piolhemalbamhi单酶切，3泳道为piolhemalkpni单酶切，4泳道为piolhemalbamhi和kpni双酶切。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例1：肌醇诱导启动子piol的构建
采用pcr技术以谷氨酸棒杆菌13032基因组dna为模板，
利用引物iolr-f和iolr-r以及iolt-f和iolt-r分别扩增iolr基因和iolt上游500bp序列piolt500，pcr条件为94℃5min1个循环，94℃30s、55℃30s、72℃40s30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为50μl。将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收。
iolr-f：5'tcagttaacatgaccaccgaagctccca3'
iolr-r：5'gcgggttcagggggtgattacctggccaccagagtgg3'
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iolt-r：5'ctagaagcttcttgtctcctaagtttgtcgtgcc3'
以上述序列为模板，利用引物iolr-f和iolt-r进行重叠pcr，条件为94℃5min1个循环，94℃30s、55℃30s、72℃40s30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为50μl。将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，获得肌醇诱导启动子piol。
实施例2：肌醇诱导表达质粒piol的构建
将实施例1利用限制内切酶hpaⅰ和hindⅲ双切后，将pxmj19用限制内切酶hpaⅰ和hindⅲ双切后去除其原始启动子ptac和laciq，然后将二者采用t4连接酶连接后转化后大肠杆菌e.colidh5α，经筛选后获得肌醇诱导表达质粒piol。肌醇诱导表达质粒piol构建示意图如图1所示。
实施例3：5-氨基乙酰丙酸生产质粒piolhemal的构建
以谷氨酸棒杆菌13032基因组dna为模板，利用引物hema-f、hema-r、heml-f和heml-r，扩增hema、heml基因片段。pcr条件为94℃5min1个循环，94℃30s、55℃30s、72℃40s30个循环，72℃10min1个循环，反应体系为50μl。将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，获得hema和heml。
hema-f：5'cgcggatccatggtgagtgtactcatcgtaggg3'
hema-r：5'ttactccctcgtttgtgtggc3'
heml-f：
5'gccacacaaacgagggagtaagcacccaaaaacactattgacca3'
heml-r：5'cggggtacctcatgatgccttcgcttctgc3'
以基因片段hema、heml为模板，利用引物hema-f和heml-r进行重叠pcr，获得hema-heml片段。
将hema-heml经bamhi和kpni双切后，将pxmj19用限制内切酶bamhi和kpni双切，然后将二者采用t4连接酶连接后转化后大肠杆菌e.colidh5α，经筛选后获得5-氨基乙酰丙酸生产质粒piolhemal。重组质粒piolhemal酶切验证图谱如图2所示。
实施例4：5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建
以谷氨酸棒杆菌13032基因组dna为模板，利用引物glta-1和glta-2扩增柠檬酸合酶编码基因glta，利用引物gdh-1和gdh-2扩增谷氨酸脱氢酶编码基因gdh，利用引物cg-1和cg-2以及cg-3和cg-4扩增cg1890上游500bp序列pu500和下游500bp序列pd500。以piol为模板，利用引物p-1和p-2扩增piolt400。
cg-1：5'gccagtgccaagcttgcatgcaaacacagggtgctcgtggc3'
cg-2：5'
tgggagcttcggtggtcataatcttcttcccttaaaaagtgtcg3'
cg-3：
5'tggcacagggcgtcatctaattaatacctagttcttagatgaagtttcaaa3'
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p-2：
5'tttgttcggaaaaaaactcttcccttgtctcctaagtttgtcgtgcc3'
glta-1：5'ggaagagtttttttccgaacaaa3'
glta-2：5'ctgtcatgatttcctcgttcccggaagccaaggttgccatt3'
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gdh-2：5'ttagatgacgccctgtgcca3'
采用重叠pcr的方法，利用引物扩增pu500-piolt400-glta-gdh-pd500，将上述片段采用同源重组的方法连接至pk18mobsacb，获得pk-1。
将pk-1转化至谷氨酸棒杆菌13032，经筛选获得piolt400-glta-gdh整合至基因组的菌株，将实施例3所述的5-氨基乙酰丙酸生产质粒piolhemal转化至上述菌株，经筛选获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株。
实施例5：5-氨基乙酰丙酸生产菌株的构建
以谷氨酸棒杆菌13032基因组dna为模板，利用引物glta-1和glta-2扩增柠檬酸合酶编码基因glta，利用引物gdh-1和gdh-2扩增谷氨酸脱氢酶编码基因gdh，利用引物cg-1和cg-2以及cg-5和cg-4扩增cg1890上游500bp序列pa500和下游500bp序列pb500。
cg-1：5'gccagtgccaagcttgcatgcaaacacagggtgctcgtggc3'
cg-2：5'
tgggagcttcggtggtcataatcttcttcccttaaaaagtgtcg3'
cg-4：5'tatgaccatgattacgaattcccactcattaccgcccgat3'
cg-5：
5'gagcaaaataaaagaattagacattaattaattaatacctagttcttagatgaagtttcaaa3'
以大肠杆菌e.colik-12mg1655基因组dna为模板，利用引物pntab-1和pntab-2扩增转氢酶pntab，利用引物rhta-1和rhta-2扩增苏氨酸输出载体rhta；以piol为模板，利用引物p-1和p-2扩增piolt400。
pntab-1：5'
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pntab-2：5'ttacagagctttcaggattgcatc3'
rhta-1：
5'gatgcaatcctgaaagctctgtaagtgggagaaaggatgcctgg3'
rhta-2：5'ttaattaatgtctaattcttttattttgctc3'
采用重叠pcr的方法，利用引物扩增
pa500-piolt400-glta-gdh-pntab-rhta-pb500，将上述片段采用同源重组的方法连接至pk18mobsacb，获得pk-2。
将pk-2转化至谷氨酸棒杆菌13032，经筛选获得
piolt400-glta-gdh-pntab-rhta整合至基因组的菌株，将实施例3所述的5-氨基乙酰丙酸生产质粒piolhemal转化至上述菌株，经筛选获得5-氨基乙酰丙酸生产菌株。
实施例6：5-氨基乙酰丙酸生产菌株pk-1的10l发酵罐发酵
(1)种子培养：将权利5-氨基乙酰丙酸生产菌株pk-1活化后，接种至装有1l种子培养基的5l发酵罐，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，溶氧维持在10-20％，通风量1-3m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；
(2)发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6l发酵培养基的10l发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速100-3000rpm，溶氧维持在10-20％，流加浓度为60-80％w/v的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％w/v，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，发酵周期30-48h；
(3)种子培养基成分为：蔗糖10-15g/l，玉米浆15-25ml/l，酵母粉1-6g/l，(nh4)2so41-4，kh2po40.5-1.5g/l，mgso40.1-0.5g/l，feso4·7h2o0.01-0.05g/l，mnso4·h2o0.010.05g/l，ph7.0，0.075mpa高压蒸汽灭菌15min；
(4)发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/l，玉米浆5-15ml/l，豆饼水解液5-15ml/l，(nh4)2so48-20g/l，生物素0.00004g/l，ph7.0-7.2，121℃高温灭菌20min。
(5)发酵液中5-氨基乙酰丙酸(ala)的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，采用ultimate3000(thermoscientific)高效液相色谱仪测定5-氨基乙酰丙酸(ala)的含量。检测条件为：色谱柱rezexroa-organicacidh+，流动相5mmol/lh2so4，流速0.5ml/min，柱温30℃，检测波长215nm，进样量为20μl。检测结果表明，5-氨基乙酰丙酸(ala)的出峰时间约为3.1min，产量约为6.2g/l。
实施例7：5-氨基乙酰丙酸生产菌株pk-2的10l发酵罐发酵
(1)种子培养：将权利5-氨基乙酰丙酸生产菌株pk-2活化后，接种至装有1l种子培养基的5l发酵罐，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，溶氧维持在10-20％，通风量1-3m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；
(2)发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6l发酵培养基的10l发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速100-3000rpm，溶氧维持在10-20％，流加浓度为60-80％w/v的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％w/v，流加25％w/v的氨水调节发酵液ph至6.8-7.2，发酵周期30-48h；
(3)种子培养基成分为：蔗糖10-15g/l，玉米浆15-25ml/l，酵母粉1-6g/l，(nh4)2so41-4，kh2po40.5-1.5g/l，mgso40.1-0.5g/l，feso4·7h2o0.01-0.05g/l，mnso4·h2o0.010.05g/l，ph7.0，0.075mpa高压蒸汽灭菌15min；
(4)发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/l，玉米浆5-15ml/l，豆饼水解液5-15ml/l，(nh4)2so48-20g/l，生物素0.00004g/l，ph7.0-7.2，121℃高温灭菌20min。
(5)发酵液中5-氨基乙酰丙酸(ala)的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释10倍后，采用ultimate3000(thermoscientific)高效液相色谱仪测定5-氨基乙酰丙酸(ala)的含量。检测条件为：色谱柱rezexroa-organicacidh+，流动相5mmol/lh2so4，流速0.5ml/min，柱温30℃，检测波长215nm，进样量为20μl。检测结果表明，5-氨基乙酰丙酸(ala)的出峰时间约为3.1min，产量约为24.2g/l。
上述参照具体实施方式对该棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
序列表
<110>天津科技大学
<120>棒状杆菌诱导型启动子及含有该启动子的表达载体与应用
<150>2017113335859
<151>2017-12-14
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1943
<212>dna
<213>肌醇诱导启动子piol(棒状杆菌)
<220>
<221>promoter
<222>(1)..(1943)
<400>1
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