本发明涉及农作物病害检测鉴定技术和分子生物学技术领域，具体涉及一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用。
背景技术：
石榴干腐病病原菌属于半知菌亚门，鲜壳孢菌属真菌。分生孢子器球形或扁球形，分生孢子菱形，深黄色，常与黏液粘在一起。僵果上的菌丝在翌年4月中旬前后产生新的孢子器，成为此病的传播源。在我国多个省份均有发生，严重影响我国石榴生产和粮食安全。为了阻止石榴干腐病传播范围的不断扩大，对其进行快速、准确地检测鉴定尤为重要。
近年来随着分子生物学相关技术的发展，基于pcr的方法已经成功用于检测石榴干腐病菌，尽管以pcr为基础的分子鉴定方法一定程度上克服了传统形态鉴定上的缺陷，但由于检测需要pcr仪、凝胶电泳和成像系统仪等昂贵的专业仪器设备，同时需要操作人员具有一定的分子生物学专业技能，并且只能在实验室条件下完成，需要较长的时间，检测过程复杂，不能满足快速检测的需求，限制了pcr检测方法在生产中的推广应用。
环介导等温扩增技术(loop‐mediatedisothermalamplification，lamp)是notomi等开发的一种恒温扩增方法，该方法针对靶基因的6个位点设计出4条引物，利用一种具有链式置换活性的dna聚合酶(bstdnapolymerase)，在恒温条件下(60℃左右)保温30-90分钟，即可完成扩增反应。由于该反应过程中产生焦磷酸镁沉淀物，出现浑浊沉淀，因此用肉眼就判定扩增结果，也可通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判断，因此不需要专业的仪器设备，在普通水浴锅中或者其他稳定热源即可完成，具有简单、快速、高效、经济等特征。凭借快速灵敏的优越性，lamp技术已在多种花卉、植物、农作物常见病虫害的快速检测中得到了应用，极大的提高了针对植物病虫害的鉴定效率和准确率，为进一步采取适宜的防控措施控制其危害提供了便利，但目前在石榴干腐病菌的检测中尚无相关报道。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物。
本发明还提供该引物组合物的应用。
本发明进一步提供一种石榴干腐病菌lamp快速检测方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物，其特征在于，由f3、b3、fip和bip四条引物组成，所述引物f3、b3、fip和bip的核苷酸序列分别如下所示：
f3：5’-ggtcaccgtgacttcatcaa-3’；
b3：5’-ccttccactcagcagtgtc-3’；
fip：5’-caccagtaccggaggcaatgatcatgatcactggtacctcgc-3’；
bip：5’-gctggtatctccaaggatggccacgatgagctgcttgacac-3’。
本发明的lamp引物组合物在制备石榴干腐病菌检测试剂中的应用。
本发明的lamp引物组合物在检测和/或鉴定石榴干腐病菌中的应用。
一种用于检测石榴干腐病菌的试剂，包含本发明的引物组合物。
一种石榴干腐病菌lamp快速检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待检样品dna，采用ctab法提取待检样品的dna；
(2)以提取的dna为模板，利用权利要求1所述的lamp引物组合物进行lamp扩增；
(3)lamp扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：
1)向扩增产物中加入显色剂，轻晃混匀，即可观察颜色变化，扩增产物显示为黄绿色，表明待测样品中含有石榴干腐病菌；扩增产物显示为橙红色，表明待测样品中不含有石榴干腐病菌；
2)取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，观察扩增结果，如果lamp扩增产物的电泳图谱为梯状条带，表明含有石榴干腐病菌；如果扩增产物的电泳图谱无扩增条带，表明不含有石榴干腐病菌。
所述的检测方法，其特征在于步骤(2)所述lamp扩增反应体系总体积为20μl，由下列浓度体积的组分组成：
用无菌双蒸水补充扩增体系总体积到20μl。
步骤(2)所述lamp扩增的反应条件为：65℃保温60min。
所述的显色剂为sybrgreeni。
lamp反应体系优化
1.1bstdna聚合酶的优化为了节省检测成本，保证该检测方法的稳定性和可靠性，实验对bstdna聚合酶的用量进行了优化。根据bstdna聚合酶的浓度，从4u-8u进行了梯度优化，确定了lamp反应最适bstdna聚合酶单位为6.4u。
1.2mg2+浓度的优化mg2+浓度的高低，会影响到反应的扩增效率，实验在20μl反应体系中加入mgcl2(25mm)从1.6μl到4.8μl，以0.8μl递增，以确定最佳mg2+浓度为4μl。(图4)
1.3引物浓度的优化此步骤的目的是确定获得最适的引物浓度。引物浓度过高，会增大检测成本；当引物浓度过低时，扩增效率也会受到影响。实验在20μl反应体系中分别按不同配比加入外引物fip/bip及内引物f3/b3，从1:4、1:6及1:8的配比中，确定了最佳引物浓度配比为1:4。
1.4甜菜碱浓度的优化对20μl反应体系中甜菜碱浓度进行优化。反应体系中甜菜碱(4m)的加入量分别为0.8μl，1.6μl，2.4μl，3.2μl，4μl。从而筛选出最适宜浓度为甜菜碱(4m)1.6μl。
1.5为了得到最适的反应温度和时间，保证该检测方法的高效性，实验对反应参数中的反应温度(60-65℃)及时间(45-90min)进行了优化，最终确定最适的反应温度和时间分别为65℃和60min。(见图5)
本发明提供的快速检测石榴干腐病菌的分子生物学方法，具有灵敏度高，特异性强等特点，与现有技术相比，本发明的有益结果是：
1、简便易行：该检测方法通过恒温水浴锅或有稳定热源的设备就能进行实验，通过反应产物颜色变化即可判定结果，省去了昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程；
2、检测高效性：该检测方法所用检测时间不足1小时，而pcr扩增时间较长，一般需要几个小时，这样大大缩短了检测时间、提高了检测的效率；
3、特异性强：该方法通过2对引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性大大提高，假阳性出现的概率也随之降低；
4、本发明是国内外首次利用lamp技术对石榴干腐病菌进行检测，这种方法快速简便，对病害的准确诊断、及时了解病原发展动态、指导科学用药，以及降低成本和减少环境污染具有重要的现实意义；
5、本发明所采集的20份石榴样品的lamp检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合。
综上所述，本发明所建立的检测方法能准确、快速的检测出石榴干腐病菌菌株，为科学研究和生产实践提供了一种简便、快速、成本低廉的检测技术，也为石榴干腐病的早期预警及合理用药提供了理论基础和技术指导，对增加生态社会和经济效益都具有现实而深远的意义。
附图说明
图1石榴干腐病菌及其他常见病原菌lamp反应电泳谱带图
图中1电泳图谱为梯状条带，表明含有石榴干腐病菌菌株；2-23电泳图谱无扩增条带，表明不含有石榴干腐病菌菌株，其中m：2000bpmarker；1：石榴干腐病菌(coniellagranati)；2：链格孢菌(alternariaalternata)；3：葡萄座腔菌(botryosphaeriadothidea)；4：灰霉病菌(botrytiscinerea)；5：葡萄白腐病菌(coniothyriumdiplodiella)；6：胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)；7：白粉病菌(podosphaeraleucotricha)；8：苹果锈病菌(gymnosporangiumyamadae)；9：梨锈病菌(gymnosporangiumharaeanum)；10：油桃炭疽病菌(glomerellaacutata)；11：霜霉病菌(plasmoparaviticola)；12：茶拟盘多毛孢菌(pestalotiopsistheae)；13：梨干枯病菌(phomopsisfukushii)；14：围小丛壳菌(glomerellacingulata)；15：尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)；16：稻瘟病菌(pyriculariagrisea)；17：稻曲病菌(ustilaginoideavirens)；18：水稻纹枯病菌(rhizoctoniasolani)；19：串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)；20：石榴拟盘多毛孢菌(pestalotiopsispunicae)；21：核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)；22：黄曲霉菌(aspergillusflavus)；23：枇杷褐斑病菌(ascochytaeriobotryae)；24：无菌双蒸水(阴性对照)。
图2石榴干腐病菌lamp灵敏度检测电泳谱带图(模板进行梯度稀释)
图a中1-11表示在20μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg石榴干腐病菌dna为模板，进行lamp等温扩增反应，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增；9-11泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，12为无菌双蒸水(阴性对照)，电泳结果表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
图b为pcr灵敏度检测电泳图，其中m：2000bpmarker；1-9表示在25μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg的石榴干腐病菌dna为模板，进行pcr扩增反应，分别取扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-5泳道的图谱为有扩增条带，呈阳性反应，表示有扩增；6-9泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，n为无菌双蒸水(阴性对照)；由图可以看出pcr反应的灵敏度只能达到1ng。
图3为20份石榴样品的lamp反应显色图(1：石榴干腐病菌(coniellagranati)；2：无菌双蒸水；3-22：不同石榴样品的dna)
图中1为石榴干腐病菌(coniellagranati)阳性对照(黄绿色)；2为无菌双蒸水阴性对照(橙红色)；3-22为不同石榴样品的dna，图中4、5、7、8、10、13、15、16、17、18、20显黄绿色，表示石榴样品中含有石榴干腐病菌；图中，3、6、9、11、12、14、19、21、22显橙红色，表示石榴样品中不含有石榴干腐病菌。
图4为mg2+浓度对lamp反应的影响(1：无菌双蒸水；2：4.8μl；3：4μl；4：3.2μll；5：2.4μl；6：1.6μl)。
图5反应时长对lamp反应的影响(1：30min；2：45min；3：60min；4：75min；5：90min；6：无菌双蒸水)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1lamp引物的设计
从genbank中下载石榴干腐病菌的elongationfactor1-alpha基因(登录号：jq281778)基因序列，根据基因序列，采用primerexplorerv4软件设计一种lamp检测引物，包括2条外引物(f3和b3)和2条内引物(fip和bip)，引物序列分别为：
f3：5’-ggtcaccgtgacttcatcaa-3’；
b3：5’-ccttccactcagcagtgtc-3’；
fip：5’-caccagtaccggaggcaatgatcatgatcactggtacctcgc-3’；bip：5’-gctggtatctccaaggatggccacgatgagctgcttgacac-3’。
所有引物合成量均为1od，用ddh2o溶解后分装，其中f3和b3的终浓度为10μm，fip和bip的终浓度为40μm，4℃保存备用。
实施例2lamp扩增体系的建立，
运用两对特异性引物对待鉴定真菌的基因组dna进行lamp恒温扩增，lamp反应总体积为20μl，反应体系是：
用无菌双蒸水补充扩增体系总体积到20μl。
lamp扩增的反应条件为：65℃保温60min。
其中的显色剂为sybrgreeni。
实施例3石榴干腐病菌lamp反应特异性检测
本实验采用石榴干腐病菌和22种其他常见农作物病原菌为供试材料(见表1)，首先用ctab法提取石榴干腐病菌及其他常见农作物病原菌基因组dna，再以石榴干腐病菌及其他常见农作物病原菌基因组dna为模板，利用实施例2建立的反应体系，分别进行lamp扩增，当模板为石榴干腐病菌时，电泳图谱成梯状条带；当模板为其他常见农作物病原菌时，电泳无条带，说明lamp反应具有很好的特异性(见图1)。
表1本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
上表中：+表示具有lamp引物扩增条带和颜色变化；－表示无扩增条带和颜色变化。
实施例4lamp反应灵敏度检测
为了检测lamp反应的灵敏度，本实验首先用ctab法提取石榴干腐病菌的基因组dna，利用实施例2建立的lamp反应扩增体系，在20μl的反应体系中分别以10μg、1μg、100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg石榴干腐病菌dna为模板，进行lamp等温扩增反应，反应结束后，分别取扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳中电泳，得到的相应的电泳图谱，其中1-8泳道的图谱为梯状条带，呈阳性反应，表示有扩增；9-11泳道的图谱为无扩增条带，呈阴性反应，表示没有扩增，电泳结果表明lamp反应的灵敏度达到1pg。以同样的梯度浓度进行常规的pcr扩增，结果表明lamp技术的最低检测下限为1pg(图2a)，而普通pcr检测下限仅为1ng(图2b)。
实施例5lamp技术在检测石榴样品中的应用
取20份石榴样品，首先用ctab法提取20份石榴样品的dna；在利用实施例2建立的lamp反应扩增体系，在25μl的反应体系中分别以20份石榴样品的dna为模板，进行lamp等温扩增反应；反应结束后，分别加入荧光染料，观察颜色变化，结果见图3。图中1为石榴干腐病菌(coniellagranati)阳性对照，呈现黄绿色；2为无菌双蒸水阴性对照，呈橙红色；3-22分别为20个不同的石榴样品，图中4、5、7、8、10、13、15、16、17、18、20显黄绿色，表示梨石榴样品中含有石榴干腐病菌；图中3、6、9、11、12、14、19、21、22显橙红色，表示石榴样品中不含有石榴干腐病菌。
对20份石榴样品的lamp检测结果与传统分离鉴定及分子生物学鉴定结果完全吻合，该方法检测结果可靠，重复性好。
序列表
<110>安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120>一种用于石榴干腐病菌lamp快速检测的引物组合物及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(coniellagranati)
<400>1
ggtcaccgtgacttcatcaa20
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(coniellagranati)
<400>2
ccttccactcagcagtgtc19
<210>3
<211>42
<212>dna
<213>人工序列(coniellagranati)
<400>3
caccagtaccggaggcaatgatcatgatcactggtacctcgc42
<210>4
<211>41
<212>dna
<213>人工序列(coniellagranati)
<400>4
gctggtatctccaaggatggccacgatgagctgcttgacac41