本申请涉及免疫学技术领域，特别是涉及一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法。
背景技术：
菌影(bacterialghosts，bgs)也称为菌蜕，是一类去除了细菌胞浆内容物而保留其完整外壳的革兰氏阴性菌。由于菌影保存了天然细菌的细胞壁、菌毛、鞭毛等结构以及活菌的固有形态，能有效诱导特异性免疫应答，并能大量装载dna质粒，是近年来发现的一种理想的dna递送系统和疫苗佐剂，被广泛用于沙眼衣原体、hiv、幽门螺杆菌等多种病原体的疫苗研究。理论上所有革兰阴性菌都可作为菌影，目前以大肠埃希菌(escherichiacoli，e.coli)菌影(ebg)最常用。
目前制备菌影用于dna质粒装载的方法，通常是先用基因温控法制备菌影，再用悬浮法装载dna质粒。
基因裂解温控法制备菌影，是将含有噬菌体phix174裂解基因e和温控元件的质粒转化入革兰氏阴性菌，然后在较高温度(通常为39～42℃)通过热诱导激活裂解基因e，表达裂解蛋白，该裂解蛋白通过与细菌内膜或外膜融合，在多种革兰氏阴性细菌细胞膜和细胞壁上形成特异性跨膜孔道，包括核酸、核糖体在内的所有细胞质成分从跨膜通道流出，剩下的细菌空壳即为菌影。制备的菌影采用悬浮法装载质粒，该方法先将菌影冻干成干粉状，然后重悬在含有高浓度的dna质粒溶液中，再洗去未结合的dna质粒。
采用基因裂解温控法制备菌影，存在以下缺点：①仅限于革兰氏阴性菌菌影制备；②短时间内很难达到100％菌影裂解，存在潜在的危险；③操作需要多步骤，成本高且费时；④制备时对细菌的光密度(od)要求严格，当od值大于0.5细菌会持续生长，不裂解为菌影，而当od值小于0.5时，菌会全部裂解而无法获得菌影；⑤只能用少量菌获得菌影，无法放大生产。
而采用悬浮法装载dna质粒的过程中，需要将菌影冻干成粉末才可有效装载，受冻干条件限制，制备费时。
因此，如何实现菌影的制备及dna质粒的有效装载，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的为提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法；本发明提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载dna质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。
本发明提供的技术方案如下：
一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法，包括以下步骤：
a、大肠埃希菌悬液中加入caco3，sds，naoh，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；
b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入h2o2及缓冲液，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；
c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；
d、将菌影重悬液、质粒、cacl2混合，1-10℃孵育，然后30-50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。
优选地，所述步骤a中，加入的caco3终浓度为0.01-1mg/l，加入的sds终浓度为100-500mg/l，加入的naoh终浓度为10-100mg/l。
优选地，所述步骤b中，加入的h2o2具体为5％-30％的h2o2；和/或，
所述步骤c中，加入的乙醇具体为55％-75％的乙醇。
优选地，所述步骤a中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.5-10h；和/或，
所述步骤b中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.1-30min。
优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，洗涤具体为：使用缓冲液将沉淀重悬后，离心，收集沉淀；洗涤次数为1-3次。
优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，所述离心具体为：1000-5000rpm离心3-30min；
所述步骤d中，所述离心具体为：8000-15000rpm离心1-10min。
优选地，所述步骤c中，加入乙醇后，静置反应3-30min，并每隔1-5min轻微震动一次。
优选地，所述步骤d中，孵育温度为4-8℃，孵育时间为10-60h；和/或，
所述热激活处理的温度为40-45℃，热激活处理的时间为30-240s。
优选地，所述步骤d中，使用的cacl2的终浓度为2000-3000mg/l；和/或，
所述质粒的终浓度为100-200mg/l，所述菌影的终浓度为1000-8000mg/l。
优选地，所述步骤d中，冰浴反应时间为1-10min。
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法，使用化学渗透压法制备大肠埃希菌菌影，然后使用氯化钙法实现对菌影进行dna质粒的装载。本发明提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载dna质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。
具体而言，首先利用化学渗透压法将大肠埃希菌制成菌影，利用caco3，sds(十二烷基磺酸钠)，naoh的共同作用，可以在形成渗透压的同时使细菌壁保持完整。然后依次使用h2o2、乙醇进行灭活，可完全灭活细菌，得到获得100％裂解的菌影，无安全风险。相较于基因裂解温控法操作步骤多，成本高(需要有带裂解基因e和温控元件的质粒，该质粒不可商品化购买)且费时的缺点，本发明中，只需用低成本的常规化学试剂(naoh、sds、caco3、h2o2、乙醇)在适宜的浓度和温度的条件下即可高效获得菌影，且批次间稳定，可量产。
然后，将得到的菌影与目标dna质粒、氯化钙混合，通过低温孵育、热激活处理、冰浴等步骤，制备装载有dna质粒的大肠埃希菌菌影。相较于悬浮法装载质粒，需要将菌影冻干，操作繁琐的缺点，本发明中，使用化学渗透压法制备的菌影，不具备基因裂解温控法形成特异性跨膜通道，因此，本发明采用氯化钙法对化学渗透压法制备的菌影进行dna装载，利用低渗氯化钙在低温下使细胞膨胀，并与外源dna形成粘附在细胞表面的复合物。迅速在40-45℃下做短暂的热刺激后，复合物便会被细胞所吸收，从而实现装载。本发明采用氯化钙法装载质粒，方法简便，装载dna的效率(80.65％)并不低于常规方法(基因裂解温控法结合悬浮法)装载的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中化学渗透法得到的菌影的透射电镜鉴定图一；
图2为本发明实施例中化学渗透法得到的菌影的透射电镜鉴定图二；
图3为本发明实施例中未处理组的透射电镜鉴定图；
图4为本发明实施例中菌影dna的电泳鉴定图；
图5为本发明实施例中化学渗透压法菌影作用时间-菌影产率关系图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
请如图1至图5所示，本发明实施例提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法，包括以下步骤：
a、大肠埃希菌悬液中加入caco3，sds，naoh，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤后收集沉淀；
b、向步骤a洗涤后收集的沉淀中加入h2o2及缓冲液，28-40℃孵育，离心，收集沉淀，洗涤，收集沉淀；
c、向步骤b收集的沉淀中加入乙醇，静置反应，离心，收集沉淀，洗涤，加入缓冲液制得菌影重悬液；
d、将菌影重悬液、质粒、cacl2混合，1-10℃孵育，然后30-50℃热激活处理后，冰浴反应，离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法，使用化学渗透压法制备大肠埃希菌菌影，然后使用氯化钙法实现对菌影进行dna质粒的装载。本发明提供的使用化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载dna质粒的方法，具有成本低、操作简单、裂解和装载效率高，批次间稳定，可量产的优点。
具体而言，首先利用化学渗透压法将大肠埃希菌制成菌影，利用caco3，sds(十二烷基磺酸钠)，naoh的共同作用，可以在形成渗透压的同时使细菌壁保持完整。然后依次使用h2o2、乙醇进行灭活，可完全灭活细菌，得到获得100％裂解的菌影，无安全风险。相较于基因裂解温控法操作步骤多，成本高(需要有带裂解基因e和温控元件的质粒，该质粒不可商品化购买)且费时的缺点，本发明中，只需用低成本的常规化学试剂(naoh、sds、caco3、h2o2、乙醇)在适宜的浓度和温度的条件下即可高效获得菌影，且批次间稳定，可量产。
然后，将得到的菌影与目标dna质粒、氯化钙混合，通过低温孵育、热激活处理、冰浴等步骤，制备装载有dna质粒的大肠埃希菌菌影。相较于悬浮法装载质粒，需要将菌影冻干，操作繁琐的缺点，本发明中，使用化学渗透压法制备的菌影，不具备基因裂解温控法形成特异性跨膜通道，因此，本发明采用氯化钙法对化学渗透压法制备的菌影进行dna装载，利用低渗氯化钙在低温下使细胞膨胀，并与外源dna形成粘附在细胞表面的复合物。迅速在40-45℃下做短暂的热刺激后，复合物便会被细胞所吸收，从而实现装载。本发明采用氯化钙法装载质粒，方法简便，装载dna的效率(80.65％)并不低于常规方法(基因裂解温控法结合悬浮法)装载的效率。
使用的大肠埃希菌悬液，可以是将细菌平板划板、液体培养后活化得到的悬液。
优选地，所述步骤a中，加入的caco3终浓度为0.01-1mg/l，加入的sds终浓度为100-500mg/l，加入的naoh终浓度为10-100mg/l。
本发明中，步骤a中使用的caco3终浓度为0.01-1mg/l，优选0.05-0.07mg/l；加入的sds终浓度为100-500mg/l，优选为200-350mg/l；加入的naoh终浓度为10-100mg/l，优选为16-30mg/l。
优选地，所述步骤b中，加入的h2o2具体为5％-30％的h2o2；和/或，
所述步骤c中，加入的乙醇具体为55％-75％的乙醇。
先后使用h2o2、乙醇，可以彻底灭活细菌。作为优选，本发明中，加入h2o2具体为5％-30％的h2o2。当使用30％的h2o2时(浓度为5.38ml/l)，可以稀释使用，如稀释5倍使用。本发明中，加入的乙醇具体为55％-75％的乙醇，如使用60％、65％的乙醇。
本发明中使用的上述试剂，可以先配置为原液浓度，使用时再进行稀释使用，如统一稀释5倍使用。
优选地，所述步骤a中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.5-10h；和/或，
所述步骤b中，孵育温度为35-37℃，孵育时间为0.1-30min。
孵育温度可以为28-40℃，优选35-37℃。步骤a中，需要使大肠埃希菌细胞与试剂(caco3，sds，naoh)充分反应，使内容物流出而保留完整外壳，所需孵育时间较长，通常孵育时间为0.5-10h，优选2-5h，更优选3-4h。步骤b中，加入双氧水是为了灭活细菌，所需孵育时间较短，通常孵育时间为0.1-30min，优选1-10min，更优选3-5min。
优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，洗涤具体为：使用缓冲液将沉淀重悬后，离心，收集沉淀；洗涤次数为1-3次。
优选地，所述步骤a或所述步骤b或所述步骤c中，所述离心具体为：1000-5000rpm离心3-30min；
所述步骤d中，所述离心具体为：8000-15000rpm离心1-10min。
在大肠埃希菌细胞与试剂(caco3，sds，naoh)反应后，以及后续分别使用h2o2、乙醇灭活细菌的过程，均需要在每个步骤后进行洗涤，以去除前一步骤使用的试剂，得到较纯的大肠埃希菌菌影，再与下一步骤使用的试剂混合反应，以提高各步骤的得率，避免试剂相互影响。
通常洗涤步骤为：使用缓冲液将沉淀重悬后，离心，收集沉淀；洗涤次数为1-3次。使用的缓冲液可以是pbs，或其他细菌处理、制备菌影常规的缓冲液或稀释液。在制备菌影的过程中(即步骤a或所述步骤b或所述步骤c中)，通常在1000-5000rpm离心3-30min，优选3000-4000rpm离心5-10min，以去除试剂。而在装载dna质粒的过程中(即步骤d中)，通常在8000-15000rpm离心1-10min，优选10000-12000rpm离心5-8min，以使未装载的质粒与装载了质粒的菌影充分分离。
优选地，在加入h2o2之前的洗涤过程中，加入缓冲液pbs后，使用移液枪轻轻吹打菌影，使菌影与缓冲液混匀。
优选地，所述步骤c中，加入乙醇后，静置反应3-30min，并每隔1-5min轻微震动一次。
菌影与乙醇静置反应，反应时间为3-30min，优选5-10min；并每隔1-5min轻微震动一次。如此操作，可以使得菌影与乙醇充分接触，使乙醇能够彻底灭活细菌。
优选地，所述步骤d中，孵育温度为4-8℃，孵育时间为10-60h；和/或，
所述热激活处理的温度为40-45℃，热激活处理的时间为30-240s。
优选地，所述步骤d中，使用的cacl2的终浓度为2000-3000mg/l；和/或，
所述质粒的终浓度为100-200mg/l，所述菌影的终浓度为1000-8000mg/l。
优选地，所述步骤d中，冰浴反应时间为1-10min。
本发明的步骤d对菌影进行dna质粒的装载过程中，需要使质粒与菌影在cacl2存在的条件下充分反应，孵育时间较长，通常孵育时间为10-60h，优选20-30h；孵育温度为1-10℃，优选4-8℃。孵育完毕后，上下颠倒ep管混合4-5次，使细胞与试剂混合均匀，然后进行热激活处理，热激活处理的温度为30-50℃，优选40-45℃；热激活处理的时间为30-240s，优选60-150s，更优选90-100s。热激活处理后立即置于冰上，冰浴反应1-10min，优选5-6min，然后离心，收集沉淀，即得装载有质粒的菌影。通常将得到的装载有质粒的菌影，加入缓冲液(如pbs)制成重悬液直接使用，或-20℃保存备用。
步骤d中使用的cacl2的终浓度为2000-3000mg/l，优选2500-2800mg/l。可以先配置成较高浓度的原液，然后稀释使用。使用的质粒的终浓度为100-200mg/l，优选150-200mg/l；所述菌影的终浓度为1000-8000mg/l，优选5000-6000mg/l。
大肠埃希菌也称为大肠杆菌，是一种大肠埃希菌，目前在基因工程领域研究较多，操作简便，利于量化生产。本发明提供的制备大肠埃希菌菌影并装载dna质粒的方法，将化学渗透压法与氯化钙法结合，作用于大肠埃希菌，得到的产物装载效率高、操作便捷，且批次间稳定，可以量化生产。
实施例1化学渗透压法制备大肠埃希菌菌影ebg(e.colijm系)
1.1.1相关溶液配制(mgc(最低生长浓度))
1)sds(十二烷基硫酸钠)(5×)：1.665mg/ml
2)caco3(碳酸钙)(5×)：0.35μg/ml
3)naoh(氢氧化钠)(5×)：0.00231n
4)h2o2(30％双氧水)(5×)：5.38μl/ml
5)60％乙醇
其中，sds、caco3、naoh、h2o2稀释5倍使用。
1.1.2小量制备(4mllb培养基)
1)平板划板接菌；
2)平板挑单菌接种于3mllb液体培养基中，37℃，220rpm，摇菌12h；
3)从过夜菌液中以1:40的比例37℃，220rpm，摇菌12h；
4)4000rpm，离心10min；
5)去上清，加入1×pbs2ml，重悬菌体；
6)重复步骤4)和5)一次；
7)4000rpm离心15min，去上清，加入1×pbs2ml，重悬菌体；
8)依次加入(5×)caco3，sds，naoh各1ml，轻轻混匀；
9)37℃孵育3h；
10)4000rpm，离心20min；
11)小心吸取菌影，转移至新的离心管；
12)加入1×pbs3ml，轻轻吹打菌影，4000rpm，离心10min；
13)去上清，重复步骤12)两次；
14)去上清，加入1ml(5×)h2o2，4ml1×pbs；
15)37℃孵育5min；
16)4000rpm，离心10min，去上清，加入1×pbs5ml，重悬菌体；
17)重复步骤16)；
18)4000rpm，离心10min，去上清，加入60％乙醇，室温静置5min，每隔1min轻微震动一次；
19)4000rpm，离心10min，小心收集菌影，加入1×pbs5ml，轻微震动洗涤菌影；
20)重复步骤19)；
21)4000rpm，离心15min，小心吸去上清，电子天平称量菌影质量，加入1×pbs(灭菌)1ml，重悬菌影，标记浓度，保存于-20℃(或4℃)。
由上述方法所制备的菌影产率(4ml培养基)通常为200～400mg/ml。大量制备时，上述溶液按倍数增加。
实施例2菌影的鉴定
1.2.1透射电镜鉴定
新鲜制备的菌影(同时设未经化学物质处理组)，经常规pbs洗涤、固定、包埋、脱水和切片，透射电镜观察鉴定(由中南大学湘雅生物医学电镜实验室完成)，如附图1-附图3所示。
tem显示，电镜下所观察到的大部分细菌呈空泡状结构，保存了完整的细菌外膜形态，胞质内的内容物已经被排出，未裂解的细菌很少(附图1-2)，而未处理组含细胞浆内容物(附图3)。
1.2.2热裂解法琼脂糖电泳
1)取制备的菌影与正常活菌各10μl分别加入10μl1×pbs，95℃，10min裂解细菌；
2)各取10μl加2μl6×loadingbuffer，于手套上混匀上样，1％琼脂糖凝胶(含2μl核酸染料)；
3)90v，80ma电泳30min，紫外下凝胶成像储存。由琼脂糖电泳鉴定的附图4可知，通过化学渗透压法制备的菌影(e.colijm109bg)，经裂解后以1.0％琼脂糖凝胶电泳后发现其内部核酸已消失，表明成功制备菌影，如附图4所示。附图4中，m:dnamarkerdl5000；1:e.colijm109bg；2:e.colijm109
(注：正常活菌泳道为dna弥散光带，菌影泳道光带消失)
实施例3菌影产率时间依赖实验(e.colijm系)
1)平板划板接菌；
2)平板挑单菌接种于3mllb液体培养基中，37℃，220rpm，摇菌12h；
3)从过夜菌液中以1：40的比例37℃，220rpm，摇菌12h；
4)取处理前菌液0.4μl菌液加入至4ml1×pbs(灭菌)中，将剩余的菌液按照mic以不同处理时间(0.5h，1h，1.5h，2h，2.5h，3h，依次类推)制备菌影(不进行h2o2及60％酒精灭活)；
5)4000rpm，离心10min，用3ml1×pbs(灭菌)重悬菌影；
6)重复步骤5)；
7)分别从各时间制备的菌影重悬液中取0.4μl加入至4ml1×pbs(灭菌)中；
8)从各样品中分别取出20μl加入至180μ1×pbs(灭菌)中(1.5mlep管)，混匀后平铺于lb琼脂平板上，37℃培养箱过夜培养。次日根据平板菌落数计算菌影产生率。(计算公式：η＝(1-处理cfu/未处理cfu)×100％)
本发明中采用化学渗透压法制备菌影产率如表1及附图5所示。再经h2o2及60％酒精灭活，灭活率为100％。
表1作用时间-菌影产率关系
注：此产率未进行h2o2及60％酒精灭活。
实施例4氯化钙法装载菌影
1.4dna装载菌影(氯化钙法)
小提质粒试剂盒通常最大提取质粒(4ml菌液)为30μg(40μl)，即～700μg/ml；大提质粒试剂盒通常最大提取质粒(200ml菌液)为1.5mg(3ml)，即～500μg/ml
1)选择质粒浓度300～400μg/ml；选择菌影浓度为50mg/ml；选择cacl2初始浓度为0.1m。
2)取样混合：
3)混合后，置于4℃孵育24h(1.5ep管)；
4)取出后上下颠倒4～5次，轻微震荡，于42℃热激活处理90～100s；
5)立即置于冰上，冰浴5min；
6)12000rpm，离心5min，取上清微量(10μl),稀释后经核算蛋白仪测重组dna浓度，通过公式计算装载率。
(计算公式：η’＝(1-c装载后/c装载前)×100％)
7)小心吸去上清，加入1×pbs(灭菌)重悬装有重组质粒的菌影，-20℃备用。
pcdna3.1(-)载体的提取与装载
提取质粒检测浓度并装载制备的ebg，得到如表2所示：
表2dna装载率
上述实验表明，本发明所提供的化学渗透压法制备菌影，结合氯化钙法装载dna质粒的方法，菌影制备简单，成本低，能获得100％裂解的菌影，批次间稳定，可量产，装载方法便捷，装载效率高。本发明提供的制备菌影的方法，及装载菌影的方法，尤其适用于细菌dna质粒的装载。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。