本发明属于番石榴叶化合物提纯领域，尤其涉及一种高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法。
背景技术：
番石榴(Psidium guajava L.)属于桃金娘科，原产于美洲，现在我国广东、广西、四川、福建等地均有栽培，其叶可全年采摘，资源十分丰富。番石榴叶为番石榴的干燥叶及带叶嫩茎，其主要成分是芳香类二级代谢产物多酚类物质，实验研究证明，正是这些酚类化合物赋予番石榴叶多种功效，如软化血管，降低血脂、血糖和胆固醇，抗氧化性，抗菌活性，治疗咳嗽、减肥等。因此，提取番石榴中的多酚物质会在医药、保健品、食品和化妆品领域都具有广阔的应用前景。作为天然活性成分，番石榴多酚已经在国内外取得了一定的研究进展，然而由于以往提取方法效率低或要求高等缺陷，在工业上的使用和推广受到了极大的限制。
目前，鲜有高纯度番石榴叶多酚化合物的提取纯化方法。传统的分离纯化多酚类化合物的方法有液液萃取法、薄层色谱法和柱色谱法等，这些方法存在耗时、耗费溶剂、产量低、操作复杂及难以实现工业化等缺点。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，通过微波辅助提取技术浸提，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液用果胶酶进行酶解，冷冻离心后取上清液，浓缩后得到多酚粗提物；
(4)将所述步骤(3)浓缩后得到的多酚粗提物复溶于去离子水中，采用大孔吸附树脂进行吸附，得到的多酚提取物采用高速逆流色谱法进行一次分离纯化，得到不同馏分，然后采用制备型液相色谱法对每个馏分进行二次分离纯化，得到番石榴叶多酚类化合物单体，即所述的高纯度番石榴叶多酚类物质。
上述的提纯方法，优选的，所述步骤(1)中，过筛为过40-60目筛。
优选的，所述步骤(2)中，通过微波辅助提取技术浸提的具体操作步骤为：按1:21g/mL的料液比加入体积浓度为50％的乙醇作为浸提剂对番石榴叶粉末进行浸提，浸提的微波功率为490-650W，提取时间为130s-200s。
优选的，所述步骤(2)中，浸提次数为2-4次。
优选的，所述步骤(3)中，酶解温度为37-37.5℃，冷冻离心的转速为8000-10000r/min，时间为5-8min。
优选的，所述步骤(4)中，采用大孔吸附树脂进行吸附的具体操作包括如下步骤：通过聚苯乙烯型中、低极性大孔吸附树脂柱进行吸附，首先对大孔吸附树脂进行预处理，然后树脂上柱，样液上柱，经大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理后，得到多酚提取物。
更优选的，采用NKA-9大孔吸附树脂柱进行吸附；所述预处理是对大孔吸附树脂进行除杂和筛除干瘪颗粒以进行活化；所述树脂上柱是将活化后的树脂采用湿法上柱，以1m L/min的流速流液，缓慢加入大孔吸附树脂；所述样液上柱是以流速1mL/min对pH为2、浓度为1mg/mL的多酚粗提液上样；所述大孔吸附树脂的解吸是在吸附完成后，先用超纯水以1mL/min的流速冲洗层析柱，以去掉吸附在大孔树脂上的极性较强的杂质，洗脱体积50mL后改用pH为3、体积浓度为50％的乙醇溶液进行洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液；所述大孔吸附树脂的清洗、再生的操作方法与所述预处理的操作方法相同；所述洗脱液后续处理是将收集到的洗脱液进行浓缩，经干燥即得到多酚提取物。
优选的，所述步骤(4)中，采用高速逆流色谱法进行一次分离纯化的具体操作包括如下步骤：以正己烷-乙酸乙酯-水按体积比1∶50∶50作为溶剂体系，充分混合，静置分层，下相为固定相，上相为流动相，先以50m L·min-1的流速泵入固定相，待固定相充满管道后，打开高速逆流色谱仪主机，设置转速为800-1000r·min-1，主机反转，当达到设定转速时，以6-6.5mL·min-1的流速泵入流动相，检测波长为280nm，温度为28℃，当流动相从主机出口流出后进样，再用馏分收集器分步收集移动相，即得到不同馏分。
优选的，所述步骤(4)中，采用制备型液相色谱法对不同馏分进行二次分离纯化的具体操作包括如下步骤：采用制备型液相色谱法分离一次分离纯化得到的每个馏分，YMC-Pack ODS-A色谱柱规格为250mm×10mm，5μm，检测波长为280nm，柱温为30℃，流速为4.0-4.5mL·min-1，即得到番石榴叶多酚类化合物单体。
优选的，所述步骤(4)中，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱对所得番石榴叶多酚类化合物单体进行定性和/或定量分析。
本发明提出，最后采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对所得单体进行定性和定量分析。
大孔树脂是一类不溶于酸、碱和各种有机溶剂，具有较好吸附性的有机高分子聚合物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附量大、选择性好、吸附速度快等优点。
高速逆流色谱(HSCCC)是一种连续高效的液液分配色谱技术，具有回收率高、制备量大、溶剂污染轻等特点，可直接用于植物粗提物的分离制备，不存在因固定相不可逆吸附而造成的样品损失与变性。采用高速逆流色谱从番石榴叶中经过一次分离得到不同馏分，极大提高了制备型液相色谱法(HPLC)对单体多酚化合物的制备效率，其纯度均大于90％。该方法相比单一的制备型液相色谱法(HPLC)，具有工艺稳定、所得产品纯度高、效率高等优点，为实现工业化提供了一种快速高效的新技术。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的提纯方法，建立了微波辅助提取法、大孔吸附树脂纯化、高速逆流色谱法和制备型液相色谱一体的分离提纯方法，以番石榴叶为原料，通过微波辅助制备番石榴叶多酚粗提物，利用大孔吸附树脂和高速逆流色谱法(HSCCC)纯化分离番石榴多酚，然后采用制备型液相色谱分离制备多种高纯度的番石榴叶多酚类化合物单体，具有耗能少、提取速度快、产率和纯度高的优点。
2、本发明的提纯方法，采用高速逆流色谱从番石榴叶中经过一次分离得到不同馏分，极大提高了制备型高效液相色谱法(HPLC)对单体多酚化合物的制备效率，其纯度均大于90％；该方法相比单一的制备型高效液相色谱法(HPLC)，具有工艺稳定、所得产品纯度高、效率高等优点，为实现工业化提供了一种快速高效的新技术。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯工艺流程图。
图2是本发明实施例1中的UPLC色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过40目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，通过微波辅助提取技术浸提2-4次，按1:21g/mL的料液比加入体积浓度为50％的乙醇作为浸提剂，浸提的微波功率为490W，提取时间为130s，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液用果胶酶进行酶解，酶解温度为37℃，冷冻离心后取上清液，冷冻离心的转速为8000r/min，时间为5min，浓缩后得到多酚粗提物；
(4)将所述步骤(3)浓缩后得到的多酚粗提物复溶于去离子水中，采用NKA-9大孔吸附树脂进行吸附，得到的多酚提取物采用高速逆流色谱法进行一次分离纯化，得到不同馏分，然后采用制备型液相色谱法对不同馏分进行二次分离纯化，得到番石榴叶多酚类化合物单体，即所述的高纯度番石榴叶多酚类物质。最后采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱对所得单体进行定性或/和定量分析。
采用大孔吸附树脂进行吸附的具体操作包括如下步骤：通过聚苯乙烯型中、低极性大孔吸附树脂柱进行吸附，首先对大孔吸附树脂进行预处理→树脂上柱→样液上柱→大孔吸附树脂的解吸→大孔吸附树脂的清洗、再生→洗脱液后续处理；所述预处理是对大孔吸附树脂进行除杂和筛除干瘪颗粒以进行活化；所述树脂上柱是将活化后的树脂采用湿法上柱，以约1m L/min的流速流液，缓慢加入大孔吸附树脂；所述样液上柱是以流速1mL/min对pH为2、浓度为1mg/m L的多酚粗提液上样；所述大孔吸附树脂的解吸是在吸附完成后，先用超纯水以1mL/min的流速冲洗层析柱，以去掉吸附在大孔树脂上的极性较强的杂质，洗脱体积约50mL后改用pH为3、体积浓度为50％的乙醇溶液进行洗脱，流速为1mL/min，收集洗脱液；所述大孔吸附树脂的清洗、再生与所述预处理的操作方法相同；所述洗脱液后续处理是将收集到的洗脱液进行浓缩，经干燥即得到多酚提取物。
通过考察大孔树脂对番石榴多酚的纯化效果，通过吸附、解吸实验，选择适宜的树脂，并对其分离纯化工艺进行优化。通过吸附、解吸实验，筛选出适合分离纯化番石榴多酚的大孔树脂，并确立其纯化工艺参数。结果表明，NKA-9是纯化番石榴多酚的最佳树脂，较佳吸附条件为上样多酚浓度为1.2mg/m L，p H2.0，上样速率为1m L/min，吸附率达到90.5％；较佳的洗脱条件为乙醇浓度50％，pH为3.0，洗脱速率1m L/min，解吸率为89.3％。
采用高速逆流色谱法(HSCCC)进行一次分离纯化的具体操作包括如下步骤：以正己烷-乙酸乙酯-水按体积比1∶50∶50作为溶剂体系，充分混合，静置分层，下相为固定相，上相为流动相，先以50m L·min-1的流速泵入固定相，待固定相充满管道后，打开主机，设置转速为800r·min-1，主机反转，当达到设定转速时，以6m L·min-1的流速泵入流动相，检测波长为280nm，温度为28℃，当流动相从主机出口流出后进样，再用馏分收集器分步收集移动相，即得到不同馏分。
采用制备型液相色谱法(HPLC)对不同馏分进行二次分离纯化的具体操作包括如下步骤：采用制备型液相色谱法分离一次分离纯化得到的每个馏分，YMC-Pack ODS-A色谱柱规格为250mm×10mm，5μm，检测波长为280nm，柱温为30℃，流速为4.0mL·min-1，即得到番石榴叶多酚类化合物单体(根据不同馏分分为组分1、组分2和组分3)。经高效液相色谱检测，按照面积归一法计算，多酚化合物单体的纯度均超过90％。
采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对得到的单体进行定性和定量分析的具体操作包括如下步骤：通过UPLC-Q-TOF-MS在负离子模式下对所得单体(组分1、组分2、组分3)进行初步鉴定，并对目标离子进行二级质谱推断，结合文献报道以及与对照品对比保留时间和紫外最大吸收波长，最终鉴别儿茶素、表儿茶素、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、异槲皮苷，fertaric acid(5)和槲皮素等多酚化合物，UPLC色谱图如图2所示。
从图2可知，组分1(Fraction1)：一级质谱图中，保留时间2.57min和3.07min处获得的准分子离子峰分别为m/z289.1172[M－H－]、289.1158[M－H]－；在二级图谱中，丢失1个乙醇，得到碎片离子m/z245.1232以及m/z245.1219，推测化合物1和2为儿茶素或表儿茶素，通过与对照品对比，保留时间2.57min为儿茶素，保留时间3.07min为表儿茶素。一级图谱在保留时间6.04min处获得的准分子离子峰为m/z447.1529[M－H]－，丢失1个葡萄糖或半乳糖，得到二级碎片离子m/z285.0852，提示可能为山奈酚的葡萄糖苷或半乳糖苷，通过与对照品比对，鉴别化合物3为山奈酚-3-O-葡萄糖苷，上述质谱信息与已知文献对比基本一致。同样的，对HSCCC所得组分2(Fraction2)和组分3(Fraction3)不同组分初步鉴别，并进行二级质谱推断，结合已知文献以及与对照品对比保留时间和紫外最大吸收波长，分别鉴别异槲皮苷，苹果酸和槲皮素。
本实施例的提纯方法，建立了微波辅助提取法、大孔吸附树脂纯化、高速逆流色谱法和制备型液相色谱一体的分离提纯方法，以番石榴叶为原料，通过微波辅助制备番石榴叶多酚粗提物，利用大孔吸附树脂和高速逆流色谱法(HSCCC)纯化分离番石榴多酚，然后采用制备型液相色谱分离制备多种高纯度的番石榴叶多酚类化合物单体，具有耗能少、提取速度快、产率和纯度高的优点。
实施例2：
一种本发明的高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过60目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，通过微波辅助提取技术浸提2-4次，按1:21g/mL的料液比加入体积浓度为50％的乙醇作为浸提剂，浸提的微波功率为650W，提取时间为200s，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液用果胶酶进行酶解，酶解温度为37℃，冷冻离心后取上清液，冷冻离心的转速为8000r/min，时间为5min，浓缩后得到多酚粗提物；
(4)将所述步骤(3)浓缩后得到的多酚粗提物复溶于去离子水中，采用NKA-9大孔吸附树脂进行吸附，得到的多酚提取物采用高速逆流色谱法进行一次分离纯化，得到不同馏分，然后采用制备型液相色谱法对不同馏分进行二次分离纯化，得到番石榴叶多酚类化合物单体，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱对所得单体进行定性和定量分析，最后即所述的高纯度番石榴叶多酚类物质。
具体的，采用大孔吸附树脂，高速逆流色谱法(HSCCC)，超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和制备型液相色谱法(HPLC)的具体操作参考实施例1。
经高效液相色谱检测，按照面积归一法计算，多酚化合物单体的纯度接近实施例1的结果，均超过90％。
本实施例的提纯方法，建立了微波辅助提取法、大孔吸附树脂纯化、高速逆流色谱法和制备型液相色谱一体的分离提纯方法，以番石榴叶为原料，通过微波辅助制备番石榴叶多酚粗提物，利用大孔吸附树脂和高速逆流色谱法(HSCCC)纯化分离番石榴多酚，然后采用制备型液相色谱分离制备多种高纯度的番石榴叶多酚类化合物单体，具有耗能少、提取速度快、产率和纯度高的优点。
实施例3：
一种本发明的高纯度番石榴叶多酚类物质的提纯方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过40目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，通过微波辅助提取技术浸提2-4次，按1:21g/mL的料液比加入体积浓度为50％的乙醇作为浸提剂，浸提的微波功率为490W，提取时间为130s，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液用果胶酶进行酶解，酶解温度为37℃，冷冻离心后取上清液，冷冻离心的转速为10000r/min，时间为8min，浓缩后得到多酚粗提物；
(4)将所述步骤(3)浓缩后得到的多酚粗提物复溶于去离子水中，采用NKA-9大孔吸附树脂进行吸附，得到的多酚提取物采用高速逆流色谱法进行一次分离纯化，得到不同馏分，然后采用制备型液相色谱法对不同馏分进行二次分离纯化，得到番石榴叶多酚类化合物单体，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱对所得单体进行定性和定量分析，最后即所述的高纯度番石榴叶多酚类物质。
具体的，采用大孔吸附树脂，高速逆流色谱法(HSCCC)，超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和制备型液相色谱法(HPLC)的具体操作参考实施例1。
经高效液相色谱检测，按照面积归一法计算，多酚化合物单体的纯度接近实施例1的结果，均超过90％。
本实施例的提纯方法，建立了微波辅助提取法、大孔吸附树脂纯化、高速逆流色谱法和制备型液相色谱一体的分离提纯方法，以番石榴叶为原料，通过微波辅助制备番石榴叶多酚粗提物，利用大孔吸附树脂和高速逆流色谱法(HSCCC)纯化分离番石榴多酚，然后采用制备型液相色谱分离制备多种高纯度的番石榴叶多酚类化合物单体，具有耗能少、提取速度快、产率和纯度高的优点。