本发明涉及犬乳腺肿瘤检测技术领域，更具体地，涉及一种犬环状rna基因作为犬乳腺肿瘤诊断标志物的应用。
背景技术：
犬乳腺肿瘤（caninemammarytumor）是犬的常见的一类疾病，其成因复杂，发病机理尚不明确。许多研究已经表明，环状rna（circrna）与肿瘤的发生和发展有关。
差异基因的筛选常用的方法是高通量测序技术和基因芯片技术。高通量测序技术的目的是确定一条染色体片断上的碱基排列的顺序，它可以解决芯片技术在检测高同源小分子和短序列方面的问题，既不浪费数据又能找到新的rna。测序检测在对临床已发生疾病检出率方面略优于基因芯片，但更费时、费力。基因芯片技术是将基因片段固定在玻璃载体上，同时用荧光标记物标记被检样品的dna片段，然后将二者杂交，最后扫描结果并用软件提取、分析数据的高效的分子生物学手段。基因芯片技术的优点在于通量高、效率高、灵敏性强、成本相对低廉等。通过对差异表达基因的筛选，可以为乳腺癌的研究提供一定的理论依据。通过高通量测序技术结合生物信息学分析，可以发现与肿瘤发展相关的差异基因的相互关系、参与哪些关键通路以及相关蛋白的相互作用关系等。
近年来，高通量测序技术已被应用于各个领域的研究，为基因组学研究和临床疾病的诊断提供了强有力的手段。基于高通量测序技术的肿瘤差异基因表达谱的发掘以及与肿瘤发展相关的差异基因的筛选，能够为肿瘤的诊断和预后的标志提供重要的手段。通过差异基因表达谱并结合临床信息以及生物信息学分析，能够发现差异基因表达与肿瘤发生发展的关系，可以为肿瘤的预后及发病机制提供新的思路。
目前，高通量测序是发现新的circrna的首选方法。高通量测序技术目前已经广泛运用于各个领域，但有可能会出现假阳性和假阴性的问题，所以对获得的测序结果仍然需要进一步验证。验证和确认circrna的方法主要有rt-qpcr和nb（northernblot），但是northernblot法程序复杂并且灵敏度低，不适合临床样本的检测，因此最适用的检测方法为rt-qpcr法。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种与犬乳腺肿瘤发生发展密切相关的犬环状rna基因。
本发明的第一个目的是提供一种犬环状rna基因。
本发明的第二个目的是提供所述的犬环状rna基因的检测引物。
本发明的第三个目的是提供所述犬环状rna基因作为犬乳腺肿瘤诊断标志物的应用。
本发明的第四个目的是提供以上所述犬环状rna基因的检测引物或以上所述检测引物在制备犬乳腺肿瘤诊断试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的是提供一个犬乳腺肿瘤诊断的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
发明人通过测序结果发现了一个与犬乳腺肿瘤发生发展密切相关的基因chr3-31787160-31789517-，经过进一步查阅大量文献后从差异基因中选择了作为目标基因进行进一步研究，chr3-31787160-31789517-参与的泛素介导的蛋白酶体降解通路与恶性肿瘤的发生密切相关。本实验对犬乳腺肿瘤差异circrna的检测采用rt-qpcr法，通过特殊的引物设计及其调试，经反转录的优化和溶解曲线分析以及cdna扩增产物的测序来实现环状rna的特异性表达。此外，选用在实验组和对照组中稳定表达的actb作为内参对目的基因表达量进行标准化。实验结果表明，犬乳腺肿瘤差异circrna在犬乳腺肿瘤组织和癌旁组织中差异表达。为保证rt-qpcr技术检测组织circrna更高效和灵敏，亟待今后完善一套标准化的样本采集、分离、rt-qpcr检测技术的标准检测体系。
因此本发明要求保护一种犬环状rna基因，其核苷酸序列如seqidno：1所示。
所述犬环状rna基因为chr3-31787160-31789517-，其来源基因为herc2。
以上所述的犬环状rna基因的检测引物，所述检测引物的核苷酸序列如seqidno：2～3所示。
以上所述犬环状rna基因作为犬乳腺肿瘤诊断标志物的应用。
以上所述犬环状rna基因的检测引物或以上所述检测引物在制备犬乳腺肿瘤诊断试剂盒中的应用。
一种犬乳腺肿瘤诊断的试剂盒，所述试剂盒含有以上所述犬环状rna基因的检测引物。
优选地，所述检测引物为以上所述检测引物。
优选地，所述试剂盒还含荧光定量pcr试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明得到了一个新的犬环状rna基因，该基因在犬乳腺肿瘤组织和癌旁组织中差异表达，在犬乳腺肿瘤组织中的表达量显著高于癌旁组织，可以作为一种犬乳腺肿瘤的诊断标志物。该犬环状rna基因的检测引物检测效果准确，可以用于犬乳腺肿瘤的诊断检测。
附图说明
图1为环状rna的引物设计示意图；蓝色箭头表示的引物用于特异性检测环状rna，黑色箭头表示的引物用于特异性检测线性rna。
图2为基因chr3-31787160-31789517-熔解曲线及扩增曲线。
图3为内参基因actb熔解曲线及扩增曲线。
图4为测序样品中差异环状rna表达变化趋势。
图5为测序样品中差异环状rna表达检测。
图6为不同犬乳腺肿瘤细胞及其培养液中chr3-31787160-31789517-表达量检测。
图7为rnaser酶处理前后基因表达量变化情况。
图8为基因chr3-31787160-31789517-测序结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
样品来源：
本实验选用在广州市动物医院进行治疗并经病理确诊的犬乳腺肿瘤病例，无菌操作留取部分癌组织和癌旁正常组织（距离癌组织2cm左右）分装于冻存管，立即放入液氮保存。所有患畜均经资深病理医生的病理诊断，纳入本研究前未患其它肿瘤，且未经放射或化学药物治疗。临床分期根据who分期标准进行分类，经过病理组织学分析后，选取了3例恶性乳腺肿瘤病例的癌组织和癌旁正常组织进行研究。
主要试剂：
trizol试剂购自takara公司；氯仿、异丙醇、75%乙醇、depc水等均为国产分析纯产品；反转录试剂盒购自takara公司；real-timepcr试剂盒购自roche公司；
主要仪器及设备：
超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）、高速常温离心机（美国thermo）、高速冷冻低温离心机（德国eppendorf）、漩涡振荡器（德国ika）、lightcycler480荧光定量pcr仪（美国roche）、电子分析天平（fa1604型上海天平仪器厂）、4℃冰箱（中科美菱）、-80℃冰箱（中科美菱）、匀浆机(法国bertintechnologie)
实施例1引物的设计与合成
选取环状rna序列首尾各200bp碱基进行拼接，其中末尾200bp作为拼接后的首序列；将新拼接的碱基序列用ncbi的primer-blast进行引物设计，参数按标准选取；选取引物对时，pcr产物包含back-splicing位点；环化位点，引物在两边。
设计原则为：
（1）引物的长度一般为15bp～25bp。
（2）引物序列的gc含量一般为40%～60%。上下游引物的gc含量不能相差太大。
（3）定量pcr扩增产物长度在200bp左右。
基因chr3-31787160-31789517-（seqidno：1）的引物设计步骤如图1所示，将设计好的引物委托天一辉远生物工程有限公司合成。
实施例2组织rna的抽提、质控和cdna的合成
一、实验操作
（一）组织rna的抽提
1、组织匀浆
每50-100mg组织样品，用灭菌剪刀剪碎后放入高压灭菌处理过的匀浆管中，加入1ml的trizol试剂，用组织匀浆机破碎组织。
2、两相分离(组织细胞)
匀浆后样品于室温孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的trizol试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，室温孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。rna全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的trizol试剂的60%。
3、rna沉淀
将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的rna，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1mltrizol试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后室温孵育10分钟后，于4℃12,000×g离心10分钟。此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4、rna清洗
移去上清液，每1mltrizol试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇，清洗rna沉淀。振荡后，4℃12,000×g离心5分钟。
5、重新溶解rna沉淀
去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5～10分钟，切勿真空离心干燥。注意rna沉淀不要完全干燥，否则将大大降低rna的可溶性。溶解rna时，先加入无rna酶的水用枪反复吹打几次。获得的rna溶液保存于-70℃。
（二）rna质控
1、试剂：
te：10mm，tris-hclph8，1mmedta（tris-hcl，edta华美生物工程公司）
0.2mmops，ph7.0（mops华美生物工程公司）
0.02m乙酸钠（上海化学试剂有限公司）
0.01medta（华美生物工程公司）
甲醛(上海化学试剂有限公司)
甲醛上样染液（ambion）
goldview染料(上海赛百胜基因技术有限公司)
琼脂糖(生工生物工程有限公司)
2、紫外吸收测定法
使用nanodrop®nd-1000测定rna浓度和纯度，测量前先用溶解rna用的depc水调零，操作方法如下：
滴加1μldepc水或者rna样品至测量基座的表面。
液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，rna浓度及质量的各种参数将在电脑中自动生成文件。
一次测定完成后，用柔软的擦镜纸擦去上下基座表面上的样本液，便可进行下一个样品的测量。
测定结果（电脑自动生成的excel和jpeg文件附于实验报告文件夹中）：
(1)浓度测定
260nm处读值为1表示40ngrna/µl。
样品rna浓度计算公式为：a260×40ng/ul。具体计算如下：
rna溶于20µldepc水中，取1µl用于测定，测得a260=65.003：
rna浓度=65.003×40ng/µl=2600.12ng/µl
取1µl用来测量以后，剩余样品rna为19µl，剩余rna总量为：19µl×2600.12ng/µl=49.4µg
(2)纯度检测
rna溶液的a260/a280的比值是一种rna纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。即使比值超出这个范围，rna样品也一样可以用于一些普通实验中如northern杂交，rt-pcr和rna酶保护实验。
3、变性琼脂糖凝胶电泳(组织细胞)
a、制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×mops电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（12.3m）。
10×mops电泳缓冲液：
浓度成分
0.2mmops,ph7.0
0.02m乙酸钠
0.01medta
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×mops电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
b、准备rna样品
取3µgrna，加3倍体积的甲醛上样染液，加eb于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育5分钟使样品变性。
c、电泳
上样于胶孔中，5-6v/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2～3cm。
d、紫外透射光下观察并拍照
28s和18s核糖体rna的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提rna的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的rna（trna和5s核糖体rna）组成。在18s和28s核糖体带之间一般可以看到一片弥散的eb染色物质，可能是由mrna和其它异型rna组成。rna制备过程中如果出现dna污染，将会在28s核糖体rna带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带。rna的降解表现为核糖体rna带的弥散。
（三）cdna的合成
按照takara反转录试剂盒进行总rna的反转录，如表1。对样品进行总rna的反转录，10µl体系反转1,000ng总rna，“*”表示根据总rna的浓度计算需要加入的rna体积，
表1反转录体系：
反复吹打混匀后进行反转录，具体反转录时间如下：
37℃15min
85℃5s
-20℃保存
二、实验结果
使用nanodropnd-1000仪（agilentinc.usa）测量每个样品的rna浓度。以od260/od280值作为rna纯度指标。od260/od280值范围在1.8～2.1，rna纯度合格。
实施例3荧光定量pcr法检测测序样品中差异circrna的表达水平
通过测定实验组(癌组织)及对照组(癌旁组织)的目的基因和内参基因，进行相对定量，得出犬乳腺肿瘤相关的目的基因与对照组的目的基因的关系，采用实时荧光定量pcr技术对前期高通量测序筛选的chr3-31787160-31789517-（其核苷酸序列如seqidno.1所示）表达水平检测，actb作内参基因。
一、实验操作
将上一步中完成反转录的cdna取出，按照rochelightcycler®480实时定量pcr仪的要求，建立20µl的体系，如表2；
各基因的引物序列如表3。
表2荧光定量的体系：
表3荧光定量pcr引物序列：
其中需要按照pcr孔数配制pcrmix，轻轻混匀后分别加入各孔，以减少误差，每个样本的每个检测基因重复三次。
加样完毕以后，用封板膜封板，1500g离心pcr板96孔板2min，将板放入lightcycler®480仪器中，按照以下参数设置：
（5）结果分析
利用以下公式计算所得出的实验结果：
相对表达量=２－δδct，
公式中－δδct＝（实验组目的基因ct值－实验组内参基因ct值）－（对照组目的基因ct值－对照组内参基因ct值），
利用spss20.0软件对各组内数据采用配对样本t检验分析，p＜0．05为有显著性差异。
二、实验结果
图2为基因chr3-31787160-31789517-熔解曲线及扩增曲线；图3为内参基因actb熔解曲线及扩增曲线。
rt-qpcr结果显示：chr3-31787160-31789517-与高通量测序结果相一致，即在犬乳腺肿瘤组织中表达量显著上升，如图4和图5所示。
实施例4不同肿瘤细胞及其培养液中环状rna的表达量检测
一、实验操作
（1）犬乳腺肿瘤细胞的复苏
将犬乳腺肿瘤细胞chmm与chmp从液氮罐中的取出后迅速放置于37℃水浴锅中，不断摇晃冻存管使冻存管中的液体快速溶化，然后在超净工作台中将冻存管中的液体吸至15ml离心管中，加入10ml的不完全培养基将液体吹打混匀；离心机2,000rpm离心5min，离心后可见管底有少量白色沉淀；将上清液弃去后加入2ml的完全培养基重悬细胞；将液体吸入新的细胞培养瓶中，加入3ml完全培养基后吹打混匀；盖好瓶盖并标记；放置于37℃、5%co2的细胞培养箱中培养24h后观察细胞状态，若细胞瓶底只有少部分细胞漂浮在培养液中，有大部分细胞贴壁生长，表明细胞复苏成功。
（2）犬乳腺肿瘤细胞的培养
在显微镜下观察到细胞培养瓶内细胞密度达到90%左右时，可进行细胞传代。在超净工作台中吸出细胞瓶中的培养基，加入3mlpbs轻柔吹洗贴壁细胞表面后弃去，再吹洗一遍以调节ph值；沿着细胞生长面的对侧瓶壁加入1ml胰蛋白酶，将细胞瓶放平使胰蛋白酶均匀覆盖细胞表面后在倒置显微镜下观察细胞形态变化情况，待细胞间隙增大、细胞变圆时，立即吸走胰蛋白酶并弃去；加入3ml完全培养基，反复吹打细胞瓶的细胞贴壁面，一般一瓶细胞传代成3瓶，每瓶细胞分装1ml；在传代细胞的瓶中补加入4ml完全培养基，吹吸均匀后放于37℃、5%co2的细胞培养箱中培养。
（3）犬乳腺肿瘤细胞的冻存
将细胞冻存盒提前恢复成室温；将待冻存的细胞瓶放入超净工作台中，吸出细胞瓶中的培养基，加入3mlpbs轻柔吹洗贴壁细胞表面后弃去；沿着细胞生长面的对侧瓶壁加入1ml胰蛋白酶消化细胞，加入3ml完全培养基吹打细胞生长面后转移至15ml离心管中；2000rpm离心5min后弃去上清液；每瓶细胞配制1ml细胞冻存液（含90%胎牛血清和10%dmso）；在离心管中加入1ml细胞冻存液吹打沉淀使其重悬；将细胞吹打混匀的悬液吸入细胞冻存管中；做好标记并用封口膜覆盖标记和管盖后放入冻存盒中，快速将冻存盒放置于-80℃冰箱中；24h后将细胞取出并移至液氮中长期保存。
（4）chr13-62685728-62729175+在不同肿瘤细胞及其培养液中的表达量变化
每天在显微镜下观察细胞生长情况，当细胞瓶内细胞密度达到90%左右时进行传代。待每种细胞培养到第四代长满时分别收集细胞和细胞培养液，用来提取rna。细胞在第四代培养生长过程中不换液。
细胞中总rna的提取和细胞培养液中总rna的提取和cdna的合成参照实施例2中的提取步骤进行。细胞和细胞培养液均用荧光定量法检测，具体操作步骤参照实施例3。
二、实验结果
在不同肿瘤细胞中，chr3-31787160-31789517-在细胞培养液中的表达量随着肿瘤细胞中表达量的改变而改变，且变化趋势一致，如图6所示。提示chr3-31787160-31789517-可由肿瘤细胞释放到细胞培养液中，其作为犬乳腺肿瘤候选潜在生物标志物将具有可观的应用前景。
实施例5rnaser耐受性实验
一、实验操作
（1）提取犬乳腺肿瘤细胞株chmp的总rna，抽提方法参照实施例2中的提取步骤。
（2）用rnaser酶处理犬乳腺肿瘤细胞株chmp的总rna。
rnaser处理具体做法如下：
4μl10×rnaserreactionbuffer（美国epicentre），
1.2μl（24u）rnaser(美国epicentre)，
8μg总rna。
以上体系用depc水补足40μl体系。
先37℃水浴15min；然后85℃水浴3min灭活酶活性；
对照组将实验组的1.2μl（24u）rnaser用1.2μldepc水替代。
（3）对处理前后的两组各取2.5μl，经1%的琼脂糖凝胶电泳，180v，10min,检测消化前后的rna条带的变化。
（4）分别取（1）的总rna进行反转录。
（5）以（4）中的cdna为模板进行荧光定量法检测消化前后环状rna与线性rna的表达量的变化。
二、实验结果
在rnaser处理后，circrna的表达量基本不变化，chr3-31787160-31789517-的表达量有少许上升（图7），目前考虑可能是rnaserbuffer里面含有mg2+，mg2+会增强pcr反应。而线性rna（actb和gpi）的表达量则显著降低了，这进一步证实了circrna是环状的。由此可见circrna对rnaser酶不敏感，不易被降解，具备作为疾病标志物的条件。
实施例6sanger测序
一、实验操作
将实施例5中未经rnaser酶处理的对照组的rt-qpcr扩增产物保留。每个基因的产物分别取10μl做sanger测序。测序结果用dnaman软件比对。
二、实验结果
样品的cdna经qrt-pcr扩增后得到的基因chr3-31787160-31789517-的产物委托天一辉远生物工程有限公司进行sanger测序。sanger测序结果显示，可回收到信号的差异基因均与预期测序结果100%相同，序列比对结果表明，基因序列区域信号良好（图8），测序结果可靠。这也证明了引物设计和rt-qpcr反应的可靠性。
实施例7一种犬腺肿瘤诊断的试剂盒
1、一种犬乳腺肿瘤诊断的试剂盒，包含一对犬环状rna基因chr3-31787160-31789517-的检测引物，以及荧光定量pcr试剂；其中，一对犬环状rna基因chr3-31787160-31789517-的检测引物核苷酸序列如seqidno：2～3所示，还保护内参基因actb的扩增引物，核苷酸序列如seqidno：4～5所示。
2、使用方法
（1）提取待测组织的rna，经过质检之后反转录获得cdna。
（2）按照rochelightcycler®480实时定量pcr仪的要求，建立20µl的体系：dh2o（灭菌蒸馏水）6μl；sybrgreenⅰmaster10μl；pcrforwardprimer1μl；pcrreverseprimer1μl；dna模板2μl。
其中需要按照pcr孔数配制pcrmix，轻轻混匀后分别加入各孔，以减少误差，每个样本的每个检测基因重复三次。
（3）加样完毕以后，用封板膜封板，1500g离心pcr板96孔板2min，将板放入lightcycler®480仪器中，按照以下参数设置：
（4）结果分析
利用以下公式计算所得出的实验结果：
相对表达量=２－δδct，
公式中－δδct＝（实验组目的基因ct值－实验组内参基因ct值）－（对照组目的基因ct值－对照组内参基因ct值），
利用spss20.0软件对各组内数据采用配对样本t检验分析，p＜0.05为有显著性差异。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种犬环状rna基因作为犬乳腺肿瘤诊断标志物的应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>503
<212>dna
<213>canislupusfamiliaris
<400>1
gtgtgccttcagatgctgattcttctgctgccagcaataaaatcaatggtgcaaataatt60
ctaagccaaatcgcccttctcttgccaagattctcctgtcactagatggaaatctagcca120
aacagcaggccttatctcatatacttacagcattgcaaatcatgtatgccagagatgcag180
tggttggggccctcatgccagctggcatgatggccccagtggagtgtccttcattctcct240
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<211>20
<212>dna
<213>canislupusfamiliaris
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