本发明属于水产用微生物添加剂技术领域，涉及一种对水产常见致病菌维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌具有明显抑制作用的屎肠球菌(enterococcusfaecium)菌株的分离鉴定、安全性试验以及抗逆性能的鉴定及应用。
背景技术：
目前，随着人们对微生态产品的逐步认可和近年来政府对抗生素的使用限制愈来愈严，人们在寻求抗生素类产品的替代品时，将目光更多地转向了绿色、环保、高效的微生态产品。乳酸菌作为一类重要益生菌，同时也是动物肠道内的重要优势菌群，因其无毒、无残留、无副用等特点，越来越成为饲料添加剂的热门研究领域。不过由于乳酸菌类为厌氧菌，并且对高温耐受性不强，这为乳酸菌产品的应用与开发带来了障碍。而屎肠球菌具有乳酸菌类细菌中特有的抗逆性，在生产加工上有其独特的优势。因此，屎肠球菌在畜牧领域的微生态制剂，特别生物饲料添加剂应用技术上倍受亲睐。
2008年中国农业部发布公告，在《饲料添加剂品种目录》中明确规定饲用微生物添加剂的种类，屎肠球菌位列其中，成为了微生态制剂常用乳酸菌菌种。大量事实证明，屎肠球菌制剂在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高饲料报酬、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果。
尽管屎肠球菌被广泛应用，但在水产业方面，从水产动物自身中筛选出益生菌并应用的报道却相对较少。水产养殖中使用的很多益生菌并不是从水产动物或者生活环境中筛选出来，而是来自某些陆生动物，这就造成益生菌株无法定殖或不稳定。只有从宿主本身筛选出的土著微生物才可以更好地适应环境，更高效的抑制病原菌，而那些非分离自鱼类消化道的益生菌株，往往不能稳定地定殖在鱼类消化道中。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术缺陷，提供一株从鲫鱼肠道内筛选分离出的既安全又具有益生特性的益生菌。该菌株耐热性强，耐酸碱度宽泛，抗逆性高，益生性更加显著，同时对常见水产致病菌如维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均具有较明显抑制作用。利用16srdna方法鉴定该菌株为屎肠球菌(enterococcusfaecium)，并对其安全性、抗逆性及应用进行了相关试验。
本发明的屎肠球菌r8，菌株enterococcusfaecium，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为cgmccno.15229，保藏日期为2018年1月17日。
屎肠球菌r8是从鱼类肠道内分离筛选得到的，本发明采用鲫鱼。
本发明的屎肠球菌r8能够应用于水产养殖，有效定殖于肠道发挥益生作用，显著提高水产生物存活率和增重率，对常见水产致病菌维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均有明显抑制作用。
本发明的屎肠球菌r8可以以饲料添加剂的形式使用，优选的掺拌量为2w％，菌液浓度为1.0×108cfu/ml。
本发明具有如下优点：
(1)菌株来源于常见鱼类(鲫鱼)的肠道内容物，经分离筛选得到，被命名为屎肠球菌r8。对水产常见致病菌(维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌)具有明显抑制作用，为替代抗生素添加剂提供有利依据。
(2)该菌株可耐受胃酸及小肠高胆盐环境，可在肠道内定殖从而发挥益生作用。
(3)该菌株对高温耐受力较强，可耐受60℃，30min，70℃，5min存活率高达90％。这为该菌株作饲料添加剂并用于实际生产奠定基础。
(4)动物试验证明，该菌株对原宿主无毒害作用，可作饲料添加剂使用。
将该菌株制备为益生菌制剂，运用到饲料添加剂中，可大大削减水产饲料中抗生素对水环境的污染和人类健康的影响。减少细菌抗药性的产生，实现水产养殖业的可持续发展。
附图说明
图1：分离筛选的屎肠球菌株r8在mrs固体培养基上的生长状态。
图2：屎肠球菌r8的革兰氏染色阳性反应(×1000)
图3：16srdna基因pcr扩增检测结果。
图中各泳道：m：maker；1：菌株r8
图4:基于16srdna序列构建系统发育树
图5：耐胆盐试验结果
图6：耐酸性试验结果
图7：耐高温试验结果
图8：屎肠球菌r8生长曲线
具体实施方式
下面对本发明进行进一步说明。为了叙述方便，本发明中的设备略去了必要或常规的操作步骤或条件，本领域技术人员能够根据反应的需要进行任意的调整。
实施例1：益生菌菌株的分离鉴定
一、菌株的分离
样品取自市场购买的健康鲫鱼，体表用75％医用酒精消毒后，无菌解剖鲫鱼并取出肠道，按1∶10的比例加入预冷的灭菌生理盐水，样品用玻璃匀浆器充分匀浆，匀浆液按10倍系列稀释后进行mrs培养基平板涂布，37℃恒温培养24-36h后观察。选取边缘清晰、分散且大小在1mm左右的菌落进行纯培养。将纯培养物经形态学观察、革兰氏染色进行初步判定，对细菌呈单个、成对或链状的革兰氏阳性球菌进行传代保存。该发明的的菌株在mrs琼脂培养上的生长特性见图1，革兰氏染色特性见图2。
该菌株属革兰氏阳性球菌，在mrs固体琼脂培养基上的菌落形态为圆形，成对或短链状排列，呈乳白色，表面光滑，边缘整齐，菌体直径大小约0.5-1.0mm。显微镜油镜下观察，菌株细胞呈球状，单生或成对，对生和链状较少。无芽孢，无鞭毛。
二、对分离株的初步鉴定
将上述分离的菌株命名为r8，通过生理生化鉴定管(杭州滨和微生物试剂有限公司)方法进行鉴定，包括：葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇、精氨酸双水解酶、胆汁七叶苷水解试验。该菌株的胆汁七叶苷水解试验呈阳性，可水解阿拉伯糖，发酵山梨醇等，将鉴定结果(见表1)与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，2001)对比，发现菌株与肠球菌属屎肠球菌种的描述基本相一致，初步判定分离株r8为屎肠球菌。
表1屎肠球菌r8生化鉴定结果
三、对分离株r8种的确证
在上述鉴定的基础上，对菌株r8进行16srdna基因序列检测，通过构建系统发育树分析来进一步确证菌种。
(一)分离株基因组的提取步骤：采用煮沸法(陈光丽，2015)提取分离株的总dna。
(二)扩增16srdna基因的引物设计：扩增引物采用细菌通用引物,
正向引物f：5'-agagtttgatcatggctcag-3'，
反向引物r：5'-ggttaccttgttacgactt-3'。
(三)pcr扩增16srdna基因
以上述引物扩增菌株r8基因组的16srdna基因组，反应体系见表2。pcr反应程序为：95℃10min，94℃5min，55℃40s，72℃40s，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。取4lpcr产物在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳检测，胶电泳图像分析系统观察结果，将产物交由上海生物工程技术公司进行pcr产物的纯化和克隆测序。
表2菌株r816srdna的pcr反应体系
(四)基于16srdna序列构建系统发育树
通过凝胶电泳试验，检测到一条大小为1523bp目的条带(见图3)；blast比对表明与enterococcusfaecium模式菌株dsm20477(aj276355.1)序列同源性为99.87％，将测序结果提交genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，获取登录号(mf928076)，再通过blast把与菌株r8的16srdna同源性较高的同一属的18种细菌选出，用mega5.2软件对这19种序列进行同源性比对，利用neighbor-joining法构建系统发育树，分析显示菌株与enterococcusfaecium自然聚为一支(见图4)，进一步判定r8a为屎肠球菌。
实施例2：屎肠球菌菌株r8的抑菌试验
以维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌以及创伤弧菌(由天津农学院水产学院水产动物病害及免疫学实验室提供)为指示菌。采用点种法(smithp，1993)初筛、牛津杯法(刘冬梅，2006)复筛的方法进行抑菌试验，具体步骤如下：调整指示菌菌液浓度为106cfu/ml，吸取0.1ml涂布于lb琼脂培养基上，然后接种环挑取单个待测菌株点种于平板上。37℃培养24h，观察抑菌圈。
采用牛津杯法进行复筛。将活化24h后的待测菌株调整浓度为107cfu/ml，将指示菌菌液浓度调整为106cfu/ml，吸取0.1ml涂布于lb琼脂培养基上。用无菌镊子取灭菌后的牛津杯置于涂有指示菌的平板上，轻压，使杯底紧贴于培养基上。每个牛津杯加入200μl初筛的益生菌菌液，然后将平皿放入37℃的恒温箱培养24h，测抑菌圈大小。实验结果见表3。
表3屎肠球菌r8体外抑菌试验
由表3可见，该菌株对常见水产致病菌：维氏气单胞菌、溶血性葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌均有明显抑制作用。
实施例3：屎肠球菌株的安全性评价
一、溶血试验
将培养24h后的r8菌液点种于兔血平板上，在37℃下培养24h，根据菌落周围透明圈的形成来判断溶血素的产生。结果观察未产生透明圈，没有溶血反应。
二、动物性试验
将r8a菌株接种在lb琼脂培养基上，37℃培养24h后，用0.75％无菌生理盐水洗脱得到菌悬液，10倍系列稀释菌悬液，将不同稀释度的菌悬液用无菌注射器对每尾鲫鱼腹腔注射0.1ml，菌液浓度1.0×108cfu/ml，每组注射12尾作为试验组。注射同体积的无菌生理盐水作为对照组。将注射后鲫鱼放回水族箱中继续饲养，每日记录死亡情况，连续观察7d。试验结果显示，实验组与对照组相比，鲫鱼未表现异常。说明r8菌株对鲫鱼无毒害作用。
实施例4：屎肠球菌r8的抗逆性和生长特性
一、抗逆性试验
(一)耐酸性试验
将活化的屎肠球菌r8菌悬液按5％的接种量分别接种于ph为2.0、3.0、4.0中，37℃恒温培养，并将ph值为7.0的溶液设置为对照组。在2h、4h、8h后分别测定菌液的od600值。每个实验重复测定三次，求平均值。
结果如图5所示，菌株r8在酸性环境下，ph为2.0和ph为3.0的处理组生长速率显著减缓，ph为4.0的处理组生长速率虽低于ph7.0对照组，但没有显著变化。随着处理时间的延长，各实验组均有活菌检出并且表现出一定的生长趋势，其中ph为4的处理组生长情况较ph为2和ph为3的处理组好。这表明r8菌株对低ph值有较好的耐受能力，有利于抵抗胃酸环境，定殖于肠道。
(二)胆盐耐受性试验
将活化后的r8菌液按5％的接种量分别接种于胆盐浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％的溶液中，37℃恒温培养，设置胆盐浓度0％为对照组。24h后，在600nm波长下测定菌液od值，每个实验重复测定三次，求平均值。
结果如图6所示，菌株r8在胆盐浓度为0.20％、0.40％的条件下生长状态良好，较对照组无明显差异；在胆盐浓度高于0.60％环境下，菌株r8生长受到抑制。同时在对该菌株进行胆盐浓度极限测试时发现，在1.00％和1.20％胆盐浓度下，3次平行实验均发现有活菌的存在。这表明了菌株r8在胆盐耐受能力上有很突出的优势，有利于在定殖肠道并从中发挥益生作用。
(三)高温耐受性试验
将在35℃摇床培养4h后的r8菌液按5％的接种量接种到lb液体培养基中。温度设置为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，各培养2min、5min、10min、20min、30min，然后分别测定菌液的od600值。同时以37℃水浴培养做对照组。每个实验重复测定三次，取其平均值。
结果如图7所示，与对照组(37℃)相比，屎肠球菌经50℃处理5min后，菌株生长开始呈下降趋势，但较处理之前仍表现为缓慢增长；在60℃、70℃、80℃、90℃的高温条件下，活菌数均下降。60℃处理2min后，菌株呈现增长趋势，然后活菌数下降但不显著；经70℃、80℃热处理30min后，细菌数损失较大，仍有活菌存在；90℃实验组随着热处理时间的延长，活菌数呈直线下降，至30min几乎检测不到活菌。结果表明屎肠球菌r8a对80℃以下的热处理均表现出一定的耐受能力，为该菌株作饲料添加剂并应用到实际生产中奠定基础。
二、生长曲线的测定
将菌株r8菌液按5％的接种量接入至新鲜lb液体培养基中，在ph为7.0，37℃和30‰的条件下，摇床中恒温培养，在600nm波长下每2h测定一次菌液od值，持续28h。
菌株r8的生长曲线(如图8)具有四个阶段，0～4h为潜伏期，4h后就进入了对数增长期，并持续到16h，16h时菌体数量达到最高，为1.81×109cfu/ml，随后进入稳定期，24h后进入衰亡期。屎肠球菌生长速度快，增殖周期短是其作为益生菌制剂的一个很大的优势，为其作为水产动物益生菌的开发利用奠定了基础。
实施例5：屎肠球菌r8的在南美白对虾养殖中的应用
在南美白对虾标粗阶段应用屎肠球菌r8，在天津地区选择2个盖有温棚的对虾标粗土塘，每个塘0.6亩。一个塘喂虾片和开口料，同时每天按2％的比例拌喂r8菌液(108cfu/ml)；连续应用21天。另一个塘只饲喂虾片和开口料。结果显示拌喂屎肠球菌的标粗虾苗比只饲喂虾片和开口料的标粗苗成活率提高16％，增重率提高13％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。