专利名称：细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种检测临床常见细菌耐药基因的方法。本发明还涉及用于该方法的试剂盒和基因芯片。
背景技术：
全国细菌耐药监测网的统计显示，在耐药细菌中，革兰氏阴性菌占70%左右，其中以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为多，且多重耐药情 况严重；革兰氏阳性菌占30%左右，其中，葡萄球菌属占到2/3，而金黄色葡萄球菌几乎占葡萄球菌属的一半，肠球菌属占革兰氏阳性菌的1/4左右，并以粪肠球菌和屎肠球菌为主。随着感染性疾病的增多，第三代和第四代头孢菌素、碳青霉烯类以及氟喹诺酮类等超广谱抗菌药物被广泛使用，细菌的耐药情况变得日益严重，造成感染性疾病难以控制、易复发、术后感染率高、昂贵抗菌药物使用量增加等后果。耐药菌株还随着国际交流在全球范围蔓延。传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，需要先从标本中培养分离到病原菌，然后测定细菌的药物敏感性，测定的方法主要包括定性测定的纸片扩散法、K-B法，定量测定的稀释法(如肉汤稀释法，琼脂稀释法)，E试验法以及全自动药敏仪法，这些方法的成本相对较低，但测定过程复杂，耗时长。目前，临床上也有应用全自动微生物鉴定及药敏分析系统来做耐药检测，但同样需要经历培养、分离提纯、鉴定三个步骤，最顺利的情况也需要72小时才能提供药敏结果，且难以对自身生长缓慢、生长条件苛刻的细菌进行检测。此外，血清免疫学方法也可用于细菌的耐药性检测，但其假阳性率和假阴性率高，重复性差，效能也不高。鉴于临床治疗的需要，医生往往先根据流行病学资料、临床症状、体征及影像学特征等，估计可能的病原体及药敏情况，经验性应用覆盖可能病原体的抗菌药物或者相对广谱的抗菌药物，待培养结果出来后，再对抗菌药物进行调整，这严重限制了临床医师为患者及时有效地选择敏感抗菌药物，尤其不利于重症感染性疾病的及时治疗，而且很可能存在抗生素滥用的问题，助长了耐药菌的产生。通过检测细菌的耐药基因，实现临床上耐药菌的快速准确诊断，是目前临床微生物学的重要研究和发展方向，它对控制医院内感染和抢救重症感染病人具有重要的意义。β -内酰胺酶的产生是细菌对β -内酰胺类抗生素耐药的主要机制。β -内酰胺酶可由染色体和质粒介导，数量超过200种，其中，超广谱β-内酰胺酶(ESBL)超过50种，遍布于世界各地。ESBLs的产生，是革兰氏阴性肠杆菌的主要耐药机制。在医院感染中，ESBLs所涉及的菌种，几乎涵盖了所有主要的革兰氏阴性杆菌。质粒介导的喹诺酮类耐药(PMQR)基因，包括qnr(quinolone resistance)、qepA(quinolone efflux protein A)和 aac (6’)-Ib-cr 等。质粒通过接合等方式，在细菌间传递耐药基因，造成耐药性的传播。基因aac (6’ )-Ib的304位T突变为C或者A，或者535位G突变为T，导致102位色氨酸突变为精氨酸，179位天冬氨酸突变为酪氨酸，引起细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药性。
DNA回旋酶GyrA和拓扑异构酶ParC的突变是导致细菌对喹诺酮类耐药的重要机制，GyrA基因常见突变位点有83位丝氨酸(S83)突变为亮氨酸(L83)、87位天冬氨酸(D87)突变为天冬酰胺(N87)或者酪氨酸(Y87) ;ParC常见突变位点有80位丝氨酸(S80)突变为异亮氨酸(180)、84位谷氨酸(E84)突变为赖氨酸(K84)、甘氨酸(G84)或者缬氨酸(V84)。mecA基因是MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)特有的耐药基因，其编码的PBP2a蛋白代替原来的青霉素结合蛋白PBP2，细菌细胞壁的合成不能被抑制，致使β -内酰胺类药物结合靶位缺失，从而形成耐药。检测mecA基因是被认为国内外判断MRSA的金标准。氨基糖苷类修饰基因aac出’)-Ie-aph (2”)-Ia的存在，是耐高浓度庆大霉素肠球菌(HLGR)的主要原因。目前，临床微生物耐药基因的检测，基本以表型检测为主。由于耐药机制的多样性，某些耐药基因可能沉默表达，但潜在的耐药性是存在的，在合适的环境条件下，就会转·变成耐药细菌，或者将耐药基因传播给其他细菌。PCR杂交分析是检测细菌耐药基因最常见的方法，然而，在众多的耐药基因中筛选某一种或者几种耐药基因，需要做大量的重复工作。基因芯片技术，具有敏感性高、特异性强、快速、高通量等特性，与PCR杂交分析法相比，基因芯片可并行检测多种基因信息，实现大量重复工作的同步化，从而能提高检测效率。针对细菌耐药基因的检测，国内外研究者尝试了不同检测范围的基因芯片。例如，Jan Weile等开发了一种检测铜绿假单胞菌抗生素耐药性和毒力因子的基因芯片，整个过程在5个小时内完成，阳性预测值、阴性预测值、灵敏度、特异度分别为78%、91%、89 %>83 % (ffeile J et al. DNA microarray for genotyping multidrug-resistantPseudomonas aeruginosa clinical isolates[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2007,59(3) :325-338)。Miranda Batchelor等开发的革兰氏阴性杆菌耐药基因的微型芯片可以检测编码耐氨基糖苷类、甲氧苄啶、磺胺类、四环素和内酰胺类以及超广谱β _ 内酸胺酶的 47 个耐药基因(Batchelor M et al. Development of a miniaturisedmicroarray-based assay for the rapid identification of antimicrobial resistancegenes in Gram-negative bacteria[J].Int J Antimicrob Agents,2008,31 (5)440-451)。Naas等设计的芯片能检测肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌中各型β-内酰胺酶类耐药基因，包括 TEM、SHV、CTX-M、KPC 等(Naas T et al. Evaluation of a DNAmicroarray,the check-points ESBL/KPC array,for rapid detection of TEM, SHV,andCTX-M extended-spectrum beta-lactamases and KPCcarbapenemases[J]. AntimicrobAgents Chemother. 2010, 54 (8) :3086-3092)。Marco Cassone 等设计制作了覆盖 8 种细菌的65个大环内酯类耐药基因的芯片(Cassone M et al. DNA microarray for detectionof macroIide resistance genes[J]. Antimicrob.Agents Chemother,2006,50 (6)2038-2041)。我国的基因芯片技术近年来也发展较快，例如，毛红菊等设计了可以检测超广谱β内酞胺酶类耐药基因中的SHV、CTX-M的几个亚型的基因芯片，该方法由标本处理到细菌鉴定及耐药谱检测，全程仅需6-8小时(毛红菊等.利用基因芯片快速检测多种临床常见致病菌及其耐药性基因[J].中华传染病杂志，2006，24￠) :372-377)。沈定霞等设计了检测大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌产生ESBLs和AmpC酶基因的基因芯片，并对上述三种菌株共225株进行检测，除部分表型AmpC酶阳性的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌外，该芯片对所有表型ESBLs阳性菌株均能检出；同时对CTX-M基因进行了分型(沈定霞等.基因芯片技术检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌中ESBLs和AmpC酶基因[J].中国抗生素杂志，2007，32 (12) :727-731)。王雅杰等设计的基因芯片，可以对常见革兰阳性细菌同步进行细菌鉴定和耐药性检测，灵敏度和特异度均较高(王雅杰等.常见革兰阳性细菌鉴定与耐药检测基因芯片的临床应用[J].首都医科大学学报，2007，28 (2) :140-144)。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种细菌耐药基因检测试剂盒，它可以用于多种临床常见耐药细菌产生的耐药基因的同时检测。
为解决上述技术问题，本发明的细菌耐药基因检测试剂盒，包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测所述细囷耐药基因的探针；所述引物具有如SEQ ID No:l 32所不的序列或其互补链；所述探针具有如SEQ ID No :33 61所示的序列或其互补链。本发明要解决的技术问题之二是提供一种细菌耐药基因检测芯片。为解决上述技术问题，本发明的用于细菌耐药基因检测的基因芯片，包括检测待测细菌耐药基因的探针，所述探针具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互补链。所述细菌耐药基因包括0XA-23、MP、VM、aac(6’)_Ie_aph(2”)_Ia、CTX_M、KPC、CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6，) _Ib、ParC 和 GyrA。本发明要解决的技术问题之三是提供一种利用上述细菌耐药基因检测试剂盒和基因芯片进行细菌耐药基因检测的方法。为解决上述技术问题，本发明的细菌耐药基因检测方法，包括以下步骤I)利用所述试剂盒中的引物，对待测样本DNA中的耐药基因进行PCR扩增；2)将步骤I)的产物与所述试剂盒中的检测细菌耐药基因的探针进行荧光标记反应；3)将步骤2)的产物与所述芯片进行杂交反应，确定样本所含的耐药基因。本发明的细菌耐药基因检测方法及检测芯片和试剂盒，覆盖了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌所产生的最常见的16种耐药基因的检测，且检测速度快，灵敏度和特异性高，从而有助于实现临床细菌感染的快速诊断和及时有效地用药，具有显著的临床实用价值。
附图是用本发明的基因芯片对临床血液样本进行耐药基因检测得到的芯片扫描图。
具体实施例方式以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I利用本发明的试剂盒进行临床常见耐药细菌的耐药基因检测I.检测目标及引物和探针的设计本实施例的检测目标包括革兰氏阳性球菌中的金黄色葡萄球菌和肠球菌的耐药基因，以及革兰氏阴性杆菌中的肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的耐药基因。所述耐药基因没有细菌种属特异性差异，包括TEM、SHV、CTX-M、DHA、CIT、頂P、V頂、KPC> 0XA-23、qnrB、qnrS、mecA、aac (6，) -Ie-aph (2，，) -la、aac (6，) _Ib、GyrA 和 ParC,其中，aac(6，)-Ib基因设计3个突变位点，分别为T304C、T304A、G535T ；GyrA设计3个突变位点，分别为N87、Y87、L83 ；ParC设计4个突变位点，分别为180、K84、G84、V84。扩增上述耐药基因特异性片段的引物对，其正向引物和反向引物的序列长度为·15 50个核苷酸,优选为15 25个核苷酸。引物的详细信息如表I所不表I本发明的细菌耐药基因检测试剂盒包括的引物
权利要求
1.一种细菌耐药基因检测试剂盒，其特征在于包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测所述细囷耐药基因的探针；所述引物具有如SEQ ID No : I 32所不的序列或其互补链；所述探针具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互补链。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述耐药基因为OXA-23、IMP、VIM、aac (6’ ) -Ie-aph (2”) -la、CTX-M、KPC, CIT、mecA、TEM、SHV, DHA, qnrB、qnrS、aac (6’ ) _Ib、ParC 和 GyrA。
3.一种用于细菌耐药基因检测的基因芯片，其特征在于包括检测待测细菌耐药基因的探针，所述探针具有如SEQ ID No 33 61所示的序列或其互补链。
4.根据权利要求3所述的基因芯片，其特征在于，还包括阳性对照探针和阴性对照探针，所述阳性对照探针具有如SEQ ID No :62所示的序列或其互补链，所述阴性对照探针具有如SEQ ID No :63所示的序列或其互补链。
5.利用权利要求I或2所述的细菌耐药基因检测试剂盒和权利要求3或4所述的用于细菌耐药基因检测的基因芯片进行细菌耐药基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)利用所述试剂盒中的引物，对待测样本DNA中的耐药基因进行PCR扩增； 2)将步骤I)的产物与所述试剂盒中的检测细菌耐药基因的探针进行荧光标记反应； 3)将步骤2)的产物与所述基因芯片进行杂交反应，确定样本所含的耐药基因。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为=IOXPCR缓冲液I. O 2. O μ L，IOmM dNTP混合液O. I O. 4 μ L，引物混合物O. 8 I. 2 μ L，DNA聚合酶O.I O. 4 μ L,样本DNA O. 8 2 μ L,加灭菌蒸懼水补充至15 μ L。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于所述PCR的反应条件为95°C，5分钟；95°C，30 #,68°C，30 秒，共 30 个循环；68°C，3 分钟。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光标记反应的反应体系为扩增产物 2 5μ L，IOXBuffer I. 2 I. 8 μ L，5U/μ L Sequenase DNA 聚合酶 O. I O. 3 μ L，20 μ M 探针混合物 O. I O. 5 μ L，IOOmM Cy3-ddNTP O. I O. 5 μ L。
9.根据权利要求5或8所述的方法，其特征在于，所述荧光标记反应的反应条件为95。。，5 分钟；95°C，30 秒，65°C，30 秒，72°C，20 秒，共 40 个循环；72°C，5 分钟。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述杂交反应的反应体系为荧光标记的扩增产物15 25 μ L，20 X SSPE 6 15 μ L，20nmol/L阳性质控O. I O. 4 μ L，混合均匀，用灭菌水补充至30 40 μ L ;反应条件为在95°C下加热5分钟，冰上骤冷，然后与所述基因芯片在48°C下杂交反应2小时。
全文摘要
本发明公开了一种细菌耐药基因检测方法、基因芯片和试剂盒。该试剂盒包括扩增待测细菌耐药基因的引物对和检测探针。该基因芯片包括检测待测细菌耐药基因的探针。利用该试剂盒和基因芯片进行耐药基因检测的方法，包括步骤1)利用试剂盒中的引物，PCR扩增待测样本DNA中的耐药基因；2)扩增产物与试剂盒中的检测探针进行荧光标记反应；3)荧光标记的扩增产物与基因芯片进行杂交，确定样本所含耐药基因。本发明的检测方法覆盖了临床最常见的16种耐药基因的检测，有助于实现临床细菌耐药情况的快速诊断，从而可以为临床合理选择治疗药物提供支持。
文档编号C12Q1/68GK102952875SQ201110254798
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者蔡挺, 张春秀, 张顺, 陈金丝, 李巧云, 周佳菁, 肖华胜 申请人:宁波市第二医院, 上海生物芯片有限公司, 上海伯豪生物技术有限公司