本发明属于生物技术领域，具体涉及乙酸coa转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用。
背景技术
异丙醇(isopropanol)为一种仲醇。在传统工业中主要用于制药、化妆品、塑料、香料、涂料及电子工业上用作脱水剂及清洗剂。随着当今社会日益增长的能源需求，其在能源方面的应用得到重视和开发。异丙醇既可以被用作生物燃料来部分代替石化汽油，亦可取代甲醇来酯化脂肪和油从而合成生物柴油，也可脱水后生成目前只能从石油中提炼获得的丙烯。
目前异丙醇的生产主要是基于丙烯或丙酮为原料的化工路线。化学合成法工艺较为复杂且常需高温高压，具有高能耗高物耗的特性，增加了其合成成本。另外，化学合成法还会导致严重的环境污染。
传统的生物技术产业已经或正在发生技术上和结构上的重大调整，已向微生物细胞工厂方和高效生物催化为核心的生物炼制技术方向发展，传统的生物工艺逐渐地被高效、低能耗和低污染的绿色工艺和技术所取代。
在自然界中，一些梭菌中天然存在着异丙醇的代谢合成途径。该途径被认为是异丙醇合成的模式途径，起始于乙酰辅酶a经过乙酰乙酸和丙酮，最终合成异丙醇。首先，两分子的乙酰辅酶a在乙酰辅酶a酰基转移酶(acoaat)的催化下脱去辅酶a生成一分子乙酰乙酰基辅酶a。其次，生成的乙酰乙酰基辅酶a在乙酰乙酸转移酶(atod和atoa)的作用下产生乙酰乙酸，并将辅酶a转移至乙酸上再生成乙酰辅酶a。随后，乙酰乙酸被乙酰乙酸脱羧酶(adc)转化为丙酮和二氧化碳。最终，丙酮在二级乙醇脱氢酶(sadh)的催化下生成异丙醇。该途径已被构建于不同宿主微生物中用于合成异丙醇。但该代谢途径涉及乙酸的富集，理论上这不利于菌体的生长。此外，该途径依赖乙酰乙酸转移酶atod和atoa催化的乙酰乙酸的合成。然而，乙酰乙酸转移酶更倾向于乙酰乙酸的降解而非合成，不利于代谢产物异丙醇的合成。
技术实现要素：
发明目的：为解决现有技术的不足，本发明设计了一种不涉及乙酸富集以及不依赖乙酰乙酸转移酶atod和atoa的新的异丙醇合成途径，并引入大肠杆菌，通过敲除大肠杆菌基因组上atod和atoa基因达到阻断乙酰乙酸降解途径的目的。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种乙酸coa转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了所述的乙酸coa转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产异丙醇方面的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种生产异丙醇的方法。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种乙酸coa转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌构建了由多个基因构成的异丙醇合成途径的工程菌，并通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸coa转移酶的编码基因获得。
其中，本发明所述由多个基因构成的异丙醇合成途径中的多个基因包含编码乙酰乙酰基辅酶a合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶a合成酶、羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶、乙酰乙酸脱羧酶以及二级乙醇脱氢酶的基因。
其中，本发明所述大肠杆菌工程菌通过敲除宿主大肠杆菌的乙酸coa转移酶的编码基因atod和atoa获得。
其中，本发明所述宿主大肠杆菌包括escherichiacolibl21、bl21plyss、jm109、dh5α、top10、hb101、dh10b或野生型大肠杆菌中的一种。
其中，本发明所述异丙醇合成途径中编码该途径中所有基因的载体为ptrc99a系列表达载体、pstv28系列表达载体、pet21系列表达载体或pbr322系列载体中的一种或几种。
本发明所述的异丙醇合成途径为一种全新的途径。该途径的起始代谢物为乙酰辅酶a。乙酰辅酶a首先被转化为乙酰乙酰辅酶a；乙酰乙酰基辅酶a随后在羟甲戊二酸单酰辅酶a合成酶(hmgs)的作用下与乙酰辅酶a缩合成羟甲戊二酸单酰辅酶a并释放辅酶a；而羟甲戊二酸单酰辅酶a随后则在羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶(hmgl)的催化下生成乙酰辅酶a和乙酰乙酸；乙酰乙酸再被乙酰乙酸脱羧酶(adc)转化为丙酮和二氧化碳。最终，丙酮在二级乙醇脱氢酶(sadh)的催化下生成异丙醇(图1)。
其中，本发明所述编码乙酰乙酰基辅酶a合成酶的基因atob来自大肠杆菌，编码羟甲戊二酸单酰辅酶a合成酶的基因hmgs来自粪肠球菌，编码羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶的基因hmgl来自假单胞菌，编码乙酰乙酸脱羧酶的基因adc和二级乙醇脱氢酶的基因sadh均来自产丁酸梭菌。
其中，本发明所述的异丙醇合成新途径中编码羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶的基因hmgl，其基因序列经密码子优化后由人工合成获得，所述优化后的基因hmgl的dna序列如seqno：1所示。
其中，本发明所述的异丙醇合成新途径中编码乙酰乙酸脱羧酶的基因adc及编码二级乙醇脱氢酶的基因sadh，其基因序列经密码子优化后由人工合成获得，所述优化后的基因adc与基因sadh串联的dna序列如seqno：2所示。
其中，本发明所述的异丙醇合成新途径中的所有基因在进行聚合酶链式反应扩增时均人为添加了核糖体结合位点序列。
由于乙酸coa转移酶的编码基因为atod和atoa。进一步的，乙酰乙酸转移酶更倾向于乙酰乙酸的降解而非合成，不利于代谢产物异丙醇的合成，本发明所述的异丙合成涉及敲除宿主细菌基因组上的atod和atoa基因(图2)。
其中，上述的表达载体及带有核糖体结合位点序列的异丙醇合成途径的基因中，所述的带有核糖体结合位点序列的异丙醇合成途径的所有基因排列在上述的列出的任一载体上的多克隆酶切位点启动子下游，且以任意次序组合排列。
本发明内容还包括所述的乙酸coa转移酶基因缺陷型大肠杆菌工程菌在生产化合物中的应用。其中，所述化合物包括乙酸、乙醇、丙酮和异丙醇，其中，异丙醇为本发明的目标产物。
本发明内容还包括一种生产异丙醇的方法，即将所述的大肠杆菌工程菌得到异丙醇的步骤，具体地，在发酵过程中通入空气，消耗甘油、葡萄糖或其它碳源，生产异丙醇，其中：所述发酵温度为25-38℃；所述发酵体系的ph值为6.5-7.5；发酵培养基中的碳源为甘油、葡萄糖和淀粉中的一种或几种；发酵培养基中的氮源为酵母粉、蛋白胨、氨水、铵盐和尿素中的一种或几种。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供的基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除其基因组乙酸coa转移酶的编码基因atod和atoa，并在该突变体菌株内表达本发明提供的编码组成异丙醇合成代谢途径中所有的酶的基因获得。本发明所构建的重组大肠杆菌菌株在兼性厌氧的条件下可利用含葡萄糖或甘油的丰富培养基为原料合成364mg/l异丙醇。
附图说明
图1为本发明中新型异丙醇合成代谢途径；
图2为本发明中敲除大肠杆菌基因组乙酸coa转移酶的编码基因atod和atoa以阻断乙酰乙酸向乙酰乙酰辅酶a的转化；
图3为本发明中pt-isop1的质粒图谱；
图4为本发明中大肠杆菌工程菌mg1655mgδatoda产异丙醇的时间曲线图；
图5为标准品的气相检测图谱；
图6为工程菌mg1655δatoda：pt-isop1以葡萄糖为碳源的异丙醇合成气相检测图谱。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
1、大肠杆菌mg1655基因组dna的提取
采用商用细菌基因组dna快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)从1ml野生型大肠杆菌mg1655(购自美国典型培养物保藏中心)培养物中抽提mg1655全基因组dna，溶解于0.1ml超纯水。
2、粪肠球菌基因组dna的提取
采用商用细菌基因组dna快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)从1ml粪肠球菌enterococcusfaecalisatcc29212(购自美国典型培养物保藏中心)培养物中抽提全基因组dna，溶解于0.1ml超纯水。
3、乙酰乙酰基辅酶a合成酶基因atob的制备
可采用如下方法制备atob基因，也可以采用人工合成的方式得到。
以大肠杆菌mg1655基因组dna为模版，用下述引物对其进行pcr扩增：
ecatob-f：5’-catcatgtttaaacaacagaaggaatataaaatgaaa-3’；
ecatob-r：5’-atgctcgagttaattcaaccgttcaatcac-3’
引物合成时，ecatob-f引入pmei酶切位点，ecatob-r引入xhoi酶切位点。
pcr反应体系如下：1μlmg1655基因组dna，1μlecatob-f，1μlecatob-r，25μlpremixextaq，22μl超纯水。
pcr反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1.2min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用pcr产物回收试剂盒进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
4、羟甲戊二酸单酰辅酶a合成酶基因hmgs的制备
可采用如下方法制备hmgs基因，也可以采用人工合成的方式得到。
以粪肠球菌enterococcusfaecalisatcc29212基因组dna为模版，用下述引物对其进行pcr扩增：
efmvas-f：5’-atattaattaaaggagttaaagaaatgacaattg-3’；
efmvas-r：5’-aatcatgtttaaacagttagtttcgataagagcg-3’
引物合成时，efmvas-f引入paci酶切位点，efmvas-r引入pmei酶切位点。
pcr反应体系如下：1μlenterococcusfaecalisatcc29212基因组dna，1μlefmvas-f，1μlefmvas-r，25μlpremixextaq，22μl超纯水。
pcr反应条件：94℃变性5min；94℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min，4℃保温。
pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用pcr产物回收试剂盒进行纯化(生工生物工程(上海)股份有限公司)。
5、羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶基因hmgl的制备
可以采用人工合成的方式制备，也可采用体外扩增的法制备hmgl基因。
对源自假单胞菌pseudomonasmevalonii(其基因组信息源自美国国立生物技术信息中心ncbi)的hmgl(又名mvab；ncbi登陆号为m24016)基因密码子进行优化以利于其在大肠杆菌中表达。优化后的核酸序列添加核糖体结合位点序列后如seqno：1所示。该密码子优化后的基因序列有生工生物工程(上海)股份有限公司合成，合成的基因序列的5’和3’末端分别带有sali和paci酶切位点。
6、羟甲戊二酸单酰辅酶a裂解酶基因adc及二级乙醇脱氢酶基因sadh的制备
可以采用人工合成的方式制备，也可采用体外扩增的法制备adc及sadh基因。
对源自产丁酸梭菌clostridiumbeijerinckiinrrlb593(其基因组信息源自美国国立生物技术信息中心ncbi)的adc(又名adc；ncbi登录号为kt362059)及sadh(又名adh；ncbi登录号为af157307)基因密码子进行优化以利于其在大肠杆菌中表达。adc与sadh串联序列优化后的核酸序列如seqno：2所示。该密码子优化后的基因序列由生工生物工程股份有限公司合成，合成的基因序列的5’和3’末端分别带有xbai和sali酶切位点。
实施例2：表达载体pt-isop1的构建
将异丙醇合成代谢途径相关基因构建于表达载体上，如ptrc99a载体。各相关基因在表达载体上可以任意顺序排列。本例中以5’-sadh-adc-hmgl-hmgs-atob-3’的顺序排列在ptrc99a载体上多克隆酶切位点处，形成pt-isop1。具体实施步骤如下：
将纯化过的pcr产物(实施例1步骤3、4、5、6制备的各个pcr产物)及载体质粒ptrc99a分别用pcr引入的酶切位点对应的限制性内切酶pmei/xhoi，paci/pmei，sali/paci，和xbai/sali进行双酶切；琼脂糖电泳回收酶切pcr及载体大片段，通过dna连接酶将酶切后的基因片段依次于16℃连接于ptrc99a的对应酶切产物。用每次的连接反应产物转化大肠杆菌dh5α，然后涂于含100μg/mlamp(氨苄青霉素)的培养皿，37℃培养10-12h。次日挑取单菌落采用上海生工质粒小量提取试剂盒提取质粒。获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示最终的表达载体pt-isop1构建完全正确。本发明中pt-isop1的质粒图谱参见图3。
实施例3乙酸coa转移酶基因缺失突变体菌株的构建
本发明产异丙醇大肠杆菌工程菌所用的宿主大肠杆菌为乙酸coa转移酶基因缺失突变体菌株。宿主大肠杆菌可以为escherichiacolibl21(de3)、bl21(de3)plyss、jm109、dh5α、top10、hb101、dh10b或野生型大肠杆菌。基因组上缺失乙酸coa转移酶的编码基因为atod和atoa。本例中使用的原始宿主菌为野生型大肠杆菌mg1655，并通过同源重组的方法将乙酸coa转移酶的编码基因atod和atoa从其基因组上敲除，该突变体菌株命名为mg1655δatoda。具体操作方法如下：
目标基因atod和atoa在基因组上为相邻的连续排列，以pkd13质粒(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)为模板，目标基因atod和atoa的引物ecatodako-f
(5’-ctattgcctgactgtacccacaacggtgtatgcaagagggataaaaaatgattccggggatccgtcgac-3’)和ecatodako-r(5’-acgcgtcataaaacgcgatatgcgaccaatcataaatcaccccgttgcgttgtaggctggagctgcttc-3’)进行聚合酶链式反应，扩增得到中间为卡那抗性基因和frt标记、两侧为atod-atoa短同源臂的线性同源重组片段。
以mg1655为出发菌株，将携带red重组酶的pkd46质粒转入细胞中，在含氨卞霉素平板培养基上筛选得到转化子；将转化子接入有amp抗性的lb培养基，并加入终浓度为2mmol/l的阿拉伯糖作为诱导剂，30℃培养至od600＝0.6时收集菌体制备电转感受态。将pcr获得的线性同源重组片段电转化进入mg1655/pkd46感受态细胞，30℃倒置培养20小时，挑选转化子，得到带有卡那霉素抗性基因的标记mg1655δatoda(frtkm)菌株。采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将替换突变的大肠杆菌中的pkd46质粒丢失。
将辅助质粒pcp20(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)转化入mg1655δatoda(frtkm)中表达flp重组酶用于卡那抗性基因的缺失突变，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选的策略，将缺失突变的大肠杆菌中的pcp20质粒丢失，最终获得mg1655δatoda菌株。
实施例4：异丙醇合成菌株的构建及发酵
将实施例2中pt-isop1质粒电转化到实施例3中的基因敲除大肠杆菌mg1655δatoda中，得到大肠杆菌工程菌株mg1655δatoda：pt-isop1。将上述单菌落接种到含有100μg/ml氨卞霉素的5ml的lb试管培养基中37℃培养8小时，以1％(v/v)的接种量接种到含有100μg/ml氨卞霉素的50ml的发酵培养基中。
发酵培养基配方(1l)：将2g甘油、10g蛋白胨、10g酵母粉及5g氯化钠溶解于800mlph7.0-7.5的10mmmops缓冲液中并最终用10mmmops定容到1000ml。
在30℃，250rpm摇床中将接种后的大肠杆菌工程菌mg1655δatoda：pt-isop1培养物发酵至od600为0.4-0.6时加入终浓度为0.1mm的异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)作为诱导剂，并在该条件下培养。每培养12小时取一次样，用于分光光度法检测细菌生长浓度及气相色谱法检测异丙醇产量。将细菌生长浓度及异丙醇的气相色谱检测结果与取样时间点作曲线图(图4)。菌株培养到36小时后细菌生长及异丙醇产量趋于平台期，48小时后细菌生长浓度为od600＝15，异丙醇产量达到最高为364mg/l。
实施例5：异丙醇的合成检测
利用气相色谱检测最终发酵代谢产物。将实施例4制备得到的待测发酵样品离心1min后，取200μl上清液于新的ep管(剩余保存-20℃冰箱备用)，各加入600μl甲醇，轻轻颠倒混匀，然后再离心20min左右。最后，吸取上清液600μl左右于样瓶品进行气相色谱测定。检测仪器为岛津气相色谱仪gc-2010plus。被检测代谢物涉及乙醇、乙酸、丙酮及异丙醇。标准品的气相检测图谱参见图5。大肠杆菌工程菌mg1655δatoda：pt-isop1以葡萄糖为碳源的异丙醇合成气相检测图谱参见图6。
气相色谱仪操作方法：
(1)程序升温，设定起始温度为25℃，保留时间为3min，以40℃/min的速率升温到120℃，再以50℃/min的速率升温到230℃，保留时间为2min。
(2)然后设定进样口温度为250℃，fid检测器温度为280℃，进样体积为0.2μl，分流比为25:1，设定完成后，将气象色谱柱按顺序摆放在气相色谱仪中，点击start开始运作。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110>淮阴工学院
<120>乙酸coa转移酶缺陷型大肠杆菌工程菌及其应用
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>929
<212>dna
<213>hmgl人工序列(artificialsequence)
<400>1
tatgtcgacaggaggtaataaatatgcaagcggtaaaggtctttgaagtcggcccccgtg60
acggcctgcagaacgaacgccagccgctgtcggtggccgcccgtgtgggcttgatcggcg120
aactggctggcaccggcctgcggcatatcgaagccggcgccttcgtgtcgccgcgctggg180
tgccgcagatggccggcagcgacgaggtgttgcgccagttgcccagcaacgacggggtca240
gttacacggccctggtgcccaaccggcaaggcttcgaggccgcgcaacgggctggctgcc300
gcgaggtagcggtgttcgccgccgcctccgaggcgttttcgcgcaacaacatcaattgct360
ccatcgatgaaagcttcgagcgcttcaccccggtgttgcgcgccgccaacgaagcctcta420
tccgggtgcgcggttatgtatcctgcgtgctcggttgcccgttcagtggggccgttgcgc480
cggaggctgtggccaaggtcgcacgccgcctgtacgaactgggctgctacgaaatcagcc540
tgggtgacaccattggcgccggccgcccggatgaaacggctcaattgttcgagctctgcg600
cacggcaactgccggtcgcggcactggccggccacttccacgatacctggggcatggcca660
tcgccaatgtgcatgccgcactcgcgcagggtgtacgcaccttcgacagctcggtcgcgg720
gcctcggcggctgcccctactcgccgggtgccagcggtaacgtggccacggaagatctgt780
tgtacctgctgcacggcctgggctacagcaccggtgttgacctggaggcggtggcacagg840
ttggtgtgcgcatcagcgcgcagctgggcaccgccaaccgctcccgtgccggccttgccc900
tggcagcaaggagcgcccgcgaacactga929
<210>2
<211>1839
<212>dna
<213>adc与sadh串联的人工序列(artificialsequence)
<400>2
ttgctctagaaggaggtaataaatatgaaaggttttgcaatgcttggtattaataagtta60
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gcagtatctccgtgtacatcagatattcatactgtttttgagggagctcttggagatcgt180
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ctgaagttatttatgattatcttaagtaagtcgacatat1839
<210>3
<211>37
<212>dna
<213>ecatob-f(artificialsequence)
<400>3
catcatgtttaaacaacagaaggaatataaaatgaaa37
<210>4
<211>30
<212>dna
<213>ecatob-r(artificialsequence)
<400>4
atgctcgagttaattcaaccgttcaatcac30
<210>5
<211>34
<212>dna
<213>efmvas-f(artificialsequence)
<400>5
atattaattaaaggagttaaagaaatgacaattg34
<210>6
<211>34
<212>dna
<213>efmvas-r(artificialsequence)
<400>6
aatcatgtttaaacagttagtttcgataagagcg34
<210>7
<211>69
<212>dna
<213>ecatodako-f(artificialsequence)
<400>7
ctattgcctgactgtacccacaacggtgtatgcaagagggataaaaaatgattccgggga60
tccgtcgac69
<210>8
<211>69
<212>dna
<213>ecatodako-r(artificialsequence)
<400>8
acgcgtcataaaacgcgatatgcgaccaatcataaatcaccccgttgcgttgtaggctgg60
agctgcttc69