一种苯并芘半抗原的制备方法及其用途与流程

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种苯并芘半抗原的制备方法及其用途。

背景技术

苯并芘(bap)又称3,4-苯并芘，工业生产和生活过程中煤炭、石油和天然气等燃料不完全燃烧以及食物在熏制、烘烤和煎炸等高温烹调过程中都会产生bap，具有致癌性、致畸性和致突变性，在环境介质中广泛存在。苯并芘的毒性具有长期和隐匿特性，人体接触或摄入bap后能够在体内蓄积，在表现出症状前具有较长潜伏期。由于bap来源广泛，且对人体危害性较大，引起了国内外学者的广泛研究，目前国内外对苯并芘检测的研究多集中于大气、水体等环境介质及粮油、肉类等食品，最常用的检测方法有气相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱等仪器分析方法。

目前，酶联免疫吸附法(elisa)常用于大批量样品的快速筛查与检测，受到广泛的研究，如matschulat等制备了bap单克隆抗体，利用elisa方法检测了水中bap的含量，灵敏度ic50为24ng/ml；pschenitza等利用固相萃取结合elisa的方法检测食用油中的苯并芘，其检测下限为0.63μg/mg。另外，生物素-亲和素-酶联免疫吸附法(ba-elisa)等高灵敏度的免疫检测技术不断兴起，是一种将抗原抗体间的特异性识别免疫反应与酶的高效催化性能以及生物素-亲和素系统结合在一起而发展起来的非均相免疫分析技术，即将抗体或抗原生物素化，利用固相包覆的抗原或抗体专一、特异性的识别结合，再利用链酶亲和素偶联生物素化抗体，最后通过酶来催化小分子底物产生肉眼可辨别的颜色变化，由于固相结合的酶量与待测物的量呈现一定的量比关系，可实现定性或定量分析。在ba-elisa方法中，一个亲和素分子上的4个亚单位都能分别专一特异性的识别结合一个生物素分子，亲和常数高达1015mol/l，提高固相载体上结合的酶数量，减少与试剂间的非特异性识别反应，提高检测方法的灵敏度。

上述免疫分析方法均是基于抗原抗体间的特异性识别免疫反应的检测技术，bap人工免疫原的制备是建立检测bap免疫分析技术的基础。bap分子不含有能够与蛋白质偶联的活性官能基质，需要在bap小分子上引入活性官能团，以便与载体蛋白偶联，如氨基、羧基、羰基等。目前，针对bap半抗原制备方法操作步骤复杂，产率一般较低，且可选择的bap半抗原制备方法种类较少。

技术实现要素：

本发明的发明人在前期研究的基础上发现，先用苯并芘标准品进行亲电取代反应生成6-碘苯并芘，再通过heck偶联反应得苯并芘的羰基衍生物bap＝o，提供了一种苯并芘半抗原的制备方法，合成方法简单，速度快，产率高，用于制备bap人工包被原和bap人工多克隆抗体，以及建立痕量bap的免疫分析检测方法。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

一种苯并芘半抗原，分子式为c27h20o，结构式如式(ⅰ)所示，

本发明的第二方面，上述苯并芘半抗原的制备方法，合成路线如式(ⅱ)所示，

具体地，包括以下步骤：

(1)用苯并芘标准品进行碘代反应，在室温下反应48h得中间产物6-碘苯并芘，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；

(2)在反应温度为120℃的条件下，步骤(1)中所得6-碘苯并芘进行heck偶联反应15h，得苯并芘羰基衍生物，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；

(3)将步骤(2)中所得苯并芘羰基衍生物粗产品经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化，即得。

在本发明的优选实施方案中，上述苯并芘半抗原的具体制备过程为：

(1-1)取500ml三口圆底烧瓶，分别加入0.4g苯并芘、0.42gnis、10g酸性氧化铝和30ml甲苯，室温搅拌反应48h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应至原料消失为止；再将上述反应产物过滤除去残余酸性氧化铝后合并有机相，分别用饱和亚硫酸钠溶液、饱和nacl溶液、超纯水各萃取三次，所得有机相经无水mgso4干燥、过滤、减压浓缩，以及用二氯甲烷和石油醚重结晶提纯，得黄色粉末状固体物6-碘苯并芘，产率为76.2％；

(2-1)向100ml单口烧瓶中分别加入0.27mg步骤(1-1)中所得6-碘苯并芘、0.01g醋酸钯和0.02glicl，加入20mldmf溶解，再依次加入70μl4-戊烯-2-醇(1.40mmol)、200μl三乙胺(1.40mmo1)，在120℃下搅拌反应15h，并通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱监测上述反应至反应完全；

(3-1)将步骤(2-1)中的反应产物冷却至室温，并加入120ml甲苯，分别用饱和nacl溶液和超纯水各萃取三次，所得有机相经无水mgso4干燥、过滤、减压浓缩得粗产品，再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化，即得，且产率为86.2％。

本发明的第三方面，上述苯并芘半抗原在制备bap人工包被原和bap人工多克隆抗体中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明苯并芘半抗原的制备方法简单，速度快，产率较高，且制备的苯并芘半抗原可用于制备bap人工包被原和bap人工多克隆抗体，及为后续痕量bap免疫分析检测方法的建立提供基础。

附图说明

图1为本发明中bap半抗原的红外光谱图；

图2为本发明中bap半抗原的核磁共振氢谱图；

图3为本发明中bap半抗原、载体蛋白和偶联物的紫外光谱图；

图4为本发明中间接竞争ba-elisa方法检测bap的标准曲线；

图5为本发明中ba-elisa和hplc方法检测环境样品中bap结果的比较。

具体实施方式

下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，以下实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。

实施例1：bap半抗原的制备

取400mg苯并芘标准品与420mgnis溶解于30ml甲苯中，缓慢加入10g酸性氧化铝，室温下搅拌反应48h，通过展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄层色谱监测上述反应；反应液分别用饱和na2so3溶液、饱和nacl溶液和超纯水各萃取3次，再经过无水mgso4干燥及浓缩后，用石油醚和二氯甲烷重结晶纯化，得淡黄色粉末6-碘苯并芘(455.2mg)。

再取270mg6-碘苯并芘、20mg氯化锂和10mg醋酸钯溶于20mldmf中，依次加入200μl三乙胺和70μl4-戊稀-2-醇，120℃下搅拌反应15h，并用展开剂为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄层色谱显示原料点判断反应是否完全。

待反应结束后冷却至室温，向反应液中加入120ml甲苯溶剂，分别用饱和食盐水、水各萃取3次，所得有机相用无水mgso4干燥、过滤、减压浓缩，得粗产品，再经淋洗液为甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅胶色谱柱分离净化，得浅黄色粉末状产物，即为苯并芘半抗原(201.8mg)。

实施例2：bap包被原的制备

bap半抗原最关键的用途是与载体蛋白如牛血清蛋白(bsa)、卵清蛋白(ova)、钥孔虫戚血蓝蛋白(klh)等进行偶联制备出bap人工全抗原，用于多种免疫分析方法的建立以完成对环境中痕量bap的检测。其中，bap包被原ova-bap的制备过程为：

取120mg实施例1制备的bap半抗原、240mg羧甲氧基胺半盐酸盐(cmo)溶于15ml干燥吡啶中，混合物在避光条件下震荡反应，并用展开剂为氯仿:甲醇＝9:1(v/v)监控反应。待反应完全后，取540mg硼氢化钠溶于4.5mlddh2o中，加入到上述反应溶液中室温震荡反应5h，反应液在氮吹下去除溶剂，将残渣分别用盐酸溶液(ph2.0)、蒸馏水洗涤两次，60℃烘箱中烘干，得黄色bap羧基衍生物(bap-cooh)。

再称取41.15mg上述bap-cooh于小锥形瓶中，加入0.5mldmf使之溶解，顺次加入等摩尔的正丁胺(10μl)、氯甲酸异丁酯(12.5μl)，4℃磁力搅拌2h，得半抗原反应液；然后称取50mgova溶于5ml0.01m、ph7.40的磷酸盐缓冲液中，将上述半抗原反应液逐滴加入到上述蛋白质溶液中，4℃搅拌反应5h。待反应结束后，装入透析袋，用0.01m、ph7.40的磷酸盐缓冲液透析3d，低温离心分离上清液，得bap包被原ova-bap。

参见附图1-3，分别利用红外光谱、核磁共振氢谱和紫外光谱的方法表征通过上述实施例制得的bap半抗原和bap包被原。其中，

bap半抗原的红外图谱如附图1所示，bap半抗原ir(kbr)ν(cm^-1)：3042(c-h，ar，伸缩)，2875、2696(c-h，伸缩)，1696(c＝o，伸缩)，1502、1232(c-c，苯环骨架振动)，769(c-c，苯环单取代峰，弯曲)，732(c-h，弯曲)，可以看出bap半抗原中有明显的羰基基团特征峰。

bap半抗原的核磁共振氢谱如附图2所示，1hnmr(400mhzcdcl3)δ(ppm)：2.11-2.15(m,2h,4′-h),2.16(s,3h,1′-h),2.58-2.62(m,2h,3′-h),3.69-3.73(m,2h,5′-h),7.75-7.77(m,2h,8-h,9-h),7.88(dd,1h,1-h,2-h),7.91(d,1h,12-h),8.00(dd,1h,1-h),8.14(dd,1h,3-h),8.21(d.1h,4-h),8.26(d,1h,5-h),8.53-8.55(m,1h,7-h),8.99(d,1h,11-h),9.04-9.06(m,1h,10-h)，进一步证明本发明成功制得bap半抗原。

bap包被原用紫外可见分光光度计扫描鉴定，如附图3所示，ova的特征吸收峰分别出现在234nm、241nm和268nm处，bap半抗原的特征吸收峰出现在323nm，苯并芘半抗原、载体蛋白和偶联物之间的紫外吸收光谱存在着显著的关系和差异。另外，在偶联物的紫外吸收光谱中不仅分别包含ova的特征峰，还有新的吸收峰出现在373nm，可以判断半抗原与载体蛋白成功偶联。

实施例3：免疫分析检测

利用实施例2制备的bap包被原和多克隆抗体(由bap包被原连续数次免疫新西兰大白兔获得)，建立间接竞争ba-elisa检测bap。其中，ba-elisa方法的检测步骤如下：

a.包被：用0.5m、ph9.60碳酸盐缓冲液适当稀释ova-bap，加入96孔酶标板中，100μl/孔，4℃包被过夜。

b.封闭：次日倒掉包被液，每孔加入200μlpbst(0.01m、ph7.40磷酸盐缓冲液+0.05％吐温20)，重复洗板3次，用吸水纸拍干酶标板后，每孔加入200μl1％ova溶液(溶于0.01m、ph7.40磷酸盐缓冲液)，37℃温育1h。

c.用含5％dmso(v/v)的0.01mph7.40磷酸盐缓冲液梯度稀释bap标准品，制备不同浓度的bap标准溶液，在抗原-抗体结合的反应阶段，每孔分别加入50μl不同浓度的bap标准溶液和50μl生物素化bap抗体(bio-pab-bap)稀释液，同时设置阴性及空白对照孔，阴性孔加入100μl阴性血清；空白孔每孔100μl0.01mph7.40磷酸盐缓冲液，37℃温育1h。

d.辣根过氧化酶标记的亲和素(hrp-sa)：倒掉抗原-抗体反应液，pbst重复洗板3次并甩干；用pbst适当稀释辣根过氧化酶标记的链霉亲和素，每孔加入100μlhrp-sa稀释液，37℃温育1h。

e.显色：倒掉反应液，用pbst洗板5遍并并拍干酶标板，加入新鲜配置的底物显色液(tmb+h2o2)，100μl/孔，室温下避光反应15min。

f.读数：每孔加入50μl终止液(2mol/lh2so4溶液)，然后在酶标仪上测定每孔在450nm及630nm处的吸光度值(od值)。

然后用含5％dmso的0.01m、ph7.40磷酸盐缓冲液配置不同浓度的bap标准溶液，bap浓度分别为0.001ng/ml、0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml，利用上述建立的ba-elisa方法检测bap标准溶液。根据检测结果，以bap标准液浓度的对数值作为横坐标，以抑制率作为纵坐标，建立ba-elisa方法检测bap的标准曲线如图4所示，抑制率的计算如公式(1)所示，

inhibition(％)＝(1-a/a0)×100％(1)

其中，

a为样品孔对应的od值，od＝od450-od630，

a0为空白孔对应的od值；

可以看出bap浓度为0.03-35.40ng/ml时，线性范围较好，线性回归方程为y＝19.42logc0+49.681，相关系数为0.9892，ic50为1.04ng/ml，检出限lod为0.0094ng/ml。

实施例4：环境样品中bap的检测

将实施例3建立的间接竞争ba-elisa方法用于环境样品中bap浓度的检测，同时与仪器分析方法检测bap的结果进行比较，判断ba-elisa方法的准确性。其中，pm2.5样品采集于上海交通大学环境科学与工程学院附近(p1-p5)；农业土壤样品采自于上海奉贤区某农用菜地(a1-a5)；沉积物样品采自于上海青草沙水库(s1-s5)，结果如表1所示，ba-elisa与hplc方法的检测结果具有较好的相关性，如附图5所示，相关系数r²＝0.9896，所建立的ba-elisa方法准确可靠，适用于环境样品中痕量bap的定量检测。

表1：不同环境样品中bap的浓度

以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。