本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种基于fret的pcr均相检测系统及其应用。
背景技术：
snp检测是目前检测需求最多的一种基因检测。snp分型方法可谓千姿百态，但随着新技术、新方法与仪器的不断出现，有些方法已经不再使用，或者仅仅用来做辅助性验证，有些方法很高大上，但不适合大范围使用。
单核苷酸多态性是指基因组上单个碱基的改变造成的dna序列的多态性。主要是是指转换与颠换，也包括极少的插入或缺失。snp是遗传变异中最常见的，占已知多态性的90％以上，在人类基因组中广泛存在。由于其分布广，稳定遗传的特点，许多疾病易感性或药物反应差异都与其紧密相关，所以，目前越来越多地应用到分子诊断、新药开发、个体化用药、临床检验等方面。
taqman探针法，仅靠退火温度竞争一种机制来分型，arms探针法不能实时荧光检测。
美国专利us7615620b2公开了一种pcr检测系统，其中kasp法检测snp位点需要7条寡核苷酸，并且主要是终点snp分型，不适用于实时荧光snp分型。
技术实现要素：
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于fret的pcr均相检测系统及其应用，用于解决现有技术中kasp法检测snp位点需要7条寡核苷酸，并且主要是终点snp分型，不适用于实时荧光snp分型等问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种基于fret的pcr均相检测系统，包括至少一个荧光或淬灭标记的连接有标签序列的加尾引物，即可以启动dna合成的引物；与所述标签序列互补的淬灭或荧光标记的寡核苷酸序列，以及反向扩增引物。
在本发明的一些实施例中，所述标签序列的长度为9-125bp。
在本发明的一些实施例中，所述寡核苷酸序列长度为9-125bp。
在本发明的一些实施例中，所述标签序列与所述寡核苷酸序列的互补方式包括正向互补、反向互补。
在本发明的一些实施例中，荧光或淬灭基团的标记位置为所述标签序列的任意碱基位置，加尾引物上的标记基团与寡核苷酸序列上的标记基团相互靠近。
在本发明的一些实施例中，荧光标记基团选自fam、、tet、hex、vic、joe、tamra、rox、texas-red、cy3、cy5等中的至少一种。与前述基团具有类似发射波长的荧光基团均适用于本发明。
在本发明的一些实施例中，淬灭标记基团选自bhq0、bhq1、bhq2、bhq3、tamra、mgb、dabcyl、eclipse等与之类似吸收波长的淬灭基团中的至少一种。与前述基团具有类似发射波长的荧光基团均适用于本发明。
在本发明的一些实施例中，所述加尾引物为两个，其中一个加尾引物中含有如下标签序列：tggactaccatagatgtgctgc(seqidno.6)，另一个加尾引物中含有如下标签序列：acttcaccggtctggcgggttca(seqidno.7)。标签序列即为加尾序列。标签序列不限于前述两个序列，根据待检测基因的不同，也可以设计为其他标签序列。
在本发明的一些实施例中，所述荧光标记的连接有标签序列的加尾引物包括g-f1-25、a-f1-25，所述g-f1-25的核苷酸序列如下所示：
5’-fam-tggactaccatagatgtgctgcactattttcttgacccctacttacg-3’(seqidno.1)；单下划线部分序列即为标签序列。
所述a-f1-25的核苷酸序列如下所示：
5’-hex-acttcaccggtctggcgggttcaactattttcttgacccctacttaca-3’(seqidno.2)；单下划线部分序列即为标签序列。
所述淬灭标记的连接标签序列的加尾引物序列包括淬灭f、淬灭h，所述淬灭f的核苷酸序列如下所示：
5’-gcagcacatctatggtagtcca-bhq1-3’(seqidno.3)；
所述淬灭h的核苷酸序列如下所示：
5’-tgaacccgccagaccggtgaagt-bhq1-3’(seqidno.4)；
所述反向扩增引物的核苷酸序列如下所示：
tagtagacaacatacgaccac(seqidno.5)。
本发明第二方面提供上述pcr均相检测系统在单核苷酸多态性检测中的应用。
pcr过程在多次循环之后实时监测，本发明可以用于实时荧光pcr中特异靶序列的扩增检测。适用的实时荧光pcr仪器包括但不限于：appliedbiosystems(abi)公司的7300、7500、7700，roche公司的lightcycler2.0、lightcycler480，西安天隆公司的tl998a等等。pcr检测过程仅通过使用pcr退火杂交后进行监测。
本发明不限于等位基因特异性pcr、snp分型、基因缺失和病原体检测。pcr检测过程仅通过使用pcr退火杂交后进行监测。
如上所述，本发明的一种基于fret的pcr均相检测系统及其应用，具有以下有益效果：本发明在arms-pcr两条引物的5'末端分别连接一条与模板不匹配的荧光尾巴，并分别合成一条与之对应的反向互补引物序列。所设计的荧光标签序列与被检测基因不同源或不完全同源。该尾巴5'端进行荧光基团单标(fam或hex，不限于这两种)，与之互补的序列3'端用淬灭基团标记(bhq1或者bhq2等，不限于这两种)，所设计的的两个标签序列解链温度(tm值)、gc含量相近，确保在相同温度下解链状态相近。这两条加尾的荧光引物的3'端碱基分别与野生型、突变型的等位基因相结合。如果扩增引物3’端碱基完全匹配，荧光引物就会顺利延伸成为模板，淬灭尾巴会解离并释放对应荧光；若扩增引物3’端碱基形成错配，延伸就会受阻滞，荧光引物依然与淬灭引物结合，没有相应荧光释放。通过荧光定量pcr仪器可以及时观察信号，并在反应结束时立刻得到结果。
附图说明
图1a-1e显示为本发明的单引物扩增原理示意图。
图2a-2e显示为本发明的snp基因分型检测原理示意图。
图3显示为本发明实施例中带有rs662-a目的片段的质粒图谱。
图4显示为本发明实施例中带有rs662-g目的片段的质粒图谱。
图5显示为本发明实施例1中单组荧光引物扩增曲线图。
图6显示为本发明实施例2中质粒gg的双荧光引物组扩增曲线图。
图7显示为本发明实施例2中质粒aa的双荧光引物组扩增曲线图。
图8显示为本发明实施例2中质粒ga的双荧光引物组扩增曲线图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。
此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
关于一步法快速检测snp位点的方法，如双taqman探针法，可以及时检测，但是只能靠与模板的结合特异性来提高检测的特异性。而对于通过与模板结合效率和延伸机制结合的arms-pcr方法，需要增加第二个检测步骤才能得到检测结果，这样又延长了检测所需要的时间。本发明既有taqman快速出结果的优点，又有arms方法特异性的优点。这种闭管方法检测样品，只需要两个小时左右就能出结果，不但操作简单，还缩短了检测时间。最后得到的结果也更加直观，可以看图对比，容易得出结果。
单引物扩增应用
如图1a-图1e所示，在pcr引物的5’末端连接一个标签序列，简称加尾引物。这个标签序列与模板不匹配，标签序列上标记一个荧光基团(常用fam)。并存在一条与此标签反向互补的标签，互补标签连接淬灭基团(常用bhq1标记)。
两个标签互补时，荧光标签与淬灭标签互补特异结合，荧光被淬灭。加尾引物在dna聚合酶作用下启动pcr后，加尾引物参与dna新链的合成，掺入新模板中，反向引物以新链为模板合成新的模板双链。加尾引物与淬灭标签分离，荧光释放，产生的荧光信号与pcr产物的数量成正比。
snp基因分型的应用
如图2a-图2e所示，在第一个应用的基础上增加一组加尾引物与淬灭标签。两种加尾引物的标签序列标记不同的荧光(常用fam与hex)，两组淬灭标签可以标记相同的淬灭基团(常用bhq1)或者不同的淬灭基团(bhq1或bhq2)。
两个加尾引物的3’末端对应等位基因位点两种不同的基因型碱基。当加尾引物3’末端与模板完全匹配时，pcr才能启动；不匹配时，pcr被阻滞。两组加尾引物启动各自对应的模板，掺入新模板的双链中，并释放出对应的荧光，产生的两种荧光信号与各自对应的pcr产物的数量成正比，据此判断模板的基因型。
实施例1
单组荧光引物扩增实验，本实施例对构建质粒插入人类基因进行检测
表1引物序列表
截取突变位点r(r＝a/g)两端部分碱基共300bp，分别针对这两个碱基合成两个质粒：rs662-a和rs662-g，作为本实验对照的标准质控，质粒图谱如图3和图4所示。载体由上海旭冠生物科技发展有限公司提供，克隆载体：pes，抗性：ampicillin，插入位点：ecorv，菌株：dh5α，其序列如seqidno.5所示。
rs662-adna序列如下所示：
taataatcctgtaatgttcaataccttcaccttatatattatgtgtgtatgttttaattgcagtttgaatgatattgttgctgtgggacctgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacaatcctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtggcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggcaagtatgtgaactctctgaaatgtagtggatttactca(seqidno.8)。
rs662-gdna序列如下所示：
taataatcctgtaatgttcaataccttcaccttatatattatgtgtgtatgttttaattgcagtttgaatgatattgttgctgtgggacctgagcacttttatggcacaaatgatcactattttcttgacccctacttacgatcctgggagatgtatttgggtttagcgtggtcgtatgttgtctactatagtccaagtgaagttcgagtggtggcagaaggatttgattttgctaatggaatcaacatttcacccgatggcaagtatgtgaactctctgaaatgtagtggatttactca(seqidno.9)。
用单重荧光引物组(选择用hex组)扩增不同浓度的纯合质粒模板(该质粒带有目的片段rs662-a，表示为pes+rs662-a)，质粒浓度分别是106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl，tm选定58℃，反应体系如下表2：
表2hex荧光引物组的扩增实验体系
反应程序如下：95℃预变性60s，95℃变性15s，58℃退火30s，50个循环。
图5显示为tm＝58℃时，hex荧光引物组,质粒浓度与扩增曲线变化曲线图(其中质粒浓度a＝1×106copies/μl、b＝1×105copies/μl、c＝1×104copies/μl。在天隆仪器上，fam信号用蓝色曲线表示，hex信号用绿色曲线表示)。
随着模板浓度的减少，曲线ct值逐渐增加。荧光信号强度在4500-5500之间。通过计算δct，结果如表3，此方法的单组荧光引物也可以通过比对标准品来做相对定量。
表3hex荧光引物组扩增不同浓度质粒的ct值
实施例2
对rs662位点做snp检测
引物序列如下表4所示。
表4引物序列表
本实施例对人类白细胞基因进行检测，反应体系如下表5所示：
表5检测人类白细胞基因时的反应体系组成
pcr反应程序如下：95℃预变性60s，95℃变性15s，56℃退火30s，50个循环。
图6显示为质粒gg的双荧光引物组在荧光定量pcr仪器上的扩增曲线图。fam所对应的蓝色曲线很高，hex所对应的绿色曲线很低，可以看出只有fam有明显扩增，属于gg型，可以分型。
图7显示为质粒aa的双荧光引物组在荧光定量pcr仪器上的扩增曲线图。fam所对应的蓝色曲线很低，hex所对应的绿色曲线很高，可以看出只有hex有明显扩增，属于aa型，可以分型。
图8显示为质粒ga的双荧光引物组在荧光定量pcr仪器上的扩增曲线图。fam所对应的蓝色曲线与hex所对应的绿色曲线重合，可以看出，二者均有明显荧光信号释放，属于ga型，可以分型。
综上所述，本发明在arms-pcr两条引物的5'末端分别连接一条与模板不匹配的荧光尾巴，并分别合成一条与之对应的反向互补引物序列。所设计的荧光标签序列与被检测基因不同源或不完全同源。该尾巴5'端进行荧光基团单标记(fam或hex，不限于这两种)，与之互补的序列3'端用淬灭基团标记(bhq1或者bhq2等，不限于这两种)，所设计的的两个标签序列解链温度(tm值)、gc含量相近，确保在相同温度下解链状态相近。这两条加尾的荧光引物的3'端碱基分别与野生型和突变型的等位基因相结合。如果扩增引物3’端碱基完全匹配，荧光引物就会顺利延伸成为模板，淬灭尾巴会解离并释放对应荧光；若扩增引物3’端碱基形成错配，延伸就会受阻滞，荧光引物依然与淬灭引物结合，没有相应荧光释放。通过荧光定量pcr仪器可以及时观察信号，并在反应结束时立刻得到结果。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
sequencelisting
<110>王卫东
<120>一种基于fret的pcr均相检测系统及其应用
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