本发明涉及生物化工领域，具体地，本发明涉及一种腈水解酶、酰胺酶两步酶法区域、立体选择性生物催化外消旋3-氰基-5-甲基己腈(ibsn)合成普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技术：
普瑞巴林(pregabalin)，化学名(s)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(i)，是一种新型的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，gaba)受体激动剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质释放，具有良好的抗焦虑和神经病理性疼痛治疗效果(angew.chem.int.ed.,2008,47:3500-3504)。
与传统药物相比，普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、毒副作用小、持续时间长、耐受性强等优点，被认为是最有希望的抗癫痫治疗药物之一(expert.opin.inv.drug.,2003,12:663-672)。自上市以来，普瑞巴林的全球销售额快速增长，已跻身全球畅销处方药行列，市场前景十分广阔。
作为手性药物，普瑞巴林合成的关键是构建手性源。生物催化法具有反应条件温和、过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等优点成为最受瞩目的手性合成技术之一。其中，腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、原子经济性高等显著优势(j.mol.catal.b:enzym.,2006,41:75-80)。
然而，腈水解酶生物催化过程中一个挑战性的问题是副产物多，产物纯化过程繁琐，收率和光学纯度难以兼得，如专利cn1942587b利用nit-101、nit-102、nit-103和拟南芥腈水解酶催化异丁基丁二腈制备(s)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度分别对应为：产率34.2％、光学纯度96.3％e.e.；产率38.6％、光学纯度91.1％e.e.；产率35.5％、光学纯度95.5％e.e.和产率17.5％、光学纯度98.5％e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”)；为同时提高(s)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度，采用nit-102c2在氮气氛下，50个间隙反应循环累积制备产物的产率最高才提至43.2％，光学纯度提至99.0％e.e.。
专利cn103114054b提供了一种利用节杆菌zjb-09277立体选择性水解制备普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的方法：以外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物，以节杆菌zjb-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂，于ph6.5～8.0的缓冲液构成的转化反应体系中，25～50℃下反应得到(s)-3-氰基-5-甲基己酸，产物的产率及光学纯度与底物酯的种类息息相关，当底物为3-氰基-5-甲基己酸丙酯时转化率高达49.9％，但光学纯度只有86.7％e.e.；当底物为3-氰基-5-甲基己酸乙酯时光学纯度达91.2％，但转化率只有31.8％。
因此，开发能够同步提高普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和纯度，易于工业化的工艺路线，成为降低普瑞巴林生产成本的关键，对抗癫痫治疗医学发展具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提供一种区域、立体选择性生物催化外消旋异丁基丁二腈(ibsn)合成普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。该方法反应条件温和、操作简单、易行，区域和立体选择性高，合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率接近理论转化率，同时光学纯度超过99.0％，对合成高光学纯度普瑞巴林、降低普瑞巴林生产成本具有重要意义。
本发明发现某些特定腈水解酶的腈水解活性和腈水合活性与底物ibsn的β位强电负性氰基取代基具有协同作用，能够将ibsn转化成高光学纯度的(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺(ii)和(s)-3-氰基-5-甲基己酸(iii)，催化过程具有高度的立体和区域选择性。
基于上述发现，本发明提供一种普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的合成新方法：将酰胺酶与腈水解酶进行耦联并严格调控其配比，同步消除化合物ii的积累，实现一步法完成(s)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，有效提高普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和光学纯度，同时还减少了后续产物的分离纯化步骤，极大的简化了普瑞巴林的生产工艺步骤，对降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：
外消旋异丁基丁二腈(ibsn)在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(s)-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明所涉及腈水解酶的来源包括，但不限于十字花科植物芜菁(brassicarapa)腈水解酶brnit(abm55734.1)、brnit2(bag72074)、拟南芥(arabidopsisthaliana)腈水解酶atnit(np851011)和高山南芥(arabisalpine)腈水解酶aanit(kfk44999)，对所述腈水解酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示：腈水解酶对异丁基丁二腈(ibsn)的催化能力：brnit>aanit>brnit2>atnit；腈水解酶催化ibsn反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：brnit2>brnit>atnit>aanit；综合考量可知，aanit对底物ibsn的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此，腈水解酶优选为aanit。
本发明所涉及酰胺酶的来源包括，但不仅限于pantoeasp.yr343、comamonascomposti和deftiatsuruhatensiszjb-05174的酰胺酶基因pa-ami(wp_008109374)、cc-ami(wp_027015397)和dt-ami(kp943494)，对所述酰胺酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示：酰胺酶活力为pa-ami>dt-ami>cc-ami。
本发明涉及一种双酶体系催化合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸的方法，具体地，所述反应体系中的酶催化剂可为完整微生物细胞、微生物细胞破碎液、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂等形式。作为优选，所述催化体系中生物催化剂以完整微生物细胞的形式存在。
进一步优选，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供。
所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：
(1)设计含酶切位点xhoi和xbai的腈水解酶基因序列，克隆至空载体pet28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到腈水解酶基因工程菌；或，
设计含有ecori和ncoi位点的酰胺酶基因序列，克隆至空载体pet28b，构建表达载体，热击转化到大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到酰胺酶基因工程菌；
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的lb液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养6～8h后，得菌体种子液；
将上述菌体种子液以2％的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的lb液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养至菌体od600为0.6～0.8时，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，25～30℃、100～150rpm发酵10～12h，收集发酵液于0～5℃，6000～9000rpm的条件下离心10～15min，生理盐水洗涤菌体后，得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞；
所述卡那霉素的浓度为30～60mg/l；
所述异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mm。
本发明中酰胺酶的添加不仅可以消除(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累，减少后续的分离步骤，还可以提高产物(s)-3-氰基-5-甲基己酸的收率。在不积累(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的前提下，优化酰胺酶的添加量，可减少体系中菌体添加量，有利于降低工艺的生产成本；作为优选，所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。
所述转化体系中，底物ibsn初始浓度为10～150g/l。
所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。
作为优选，所述催化体系中的反应温度为30～40℃。
所述反应介质由纯水或缓冲体系组成；所述缓冲体系的ph范围约6.0-11.0，所述的缓冲体系由磷酸钠缓冲液、tris-hcl缓冲液及gly-naoh缓冲液组成，作为优选，所述催化体系中的反应介质为tris-hcl缓冲液，所述缓冲体系的ph为7.5-9.0。在弱碱性环境中，生物催化剂均保持在较高的活性。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)现有技术中，底物ibsn的浓度越大，转化越困难，产率越低，本发明可将底物ibsn的初始浓度提至150g/l。
(2)由外消旋底物ibsn合成普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率可达49.5％，e.e.为99.5％；
(3)实现一步法完成(s)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成，极大缩减了后续产物的分离纯化步骤，对简化普瑞巴林的生产工艺步骤，降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例4中腈水解酶催化ibsn水解反应液的气相色谱图。
图2为本发明实施例4中腈水解酶aanit催化ibsn水解的反应进程图。
图3为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联催化合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸的合成路线图。
图4为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化ibsn的反应进程图。
图5为本发明实施例7中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化ibsn的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参见j.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》。
实施例1构建重组腈水解酶工程菌
根据ncbi中报道的芜菁(brassicarapa)腈水解酶brnit(abm55734.1)、brnit2(bag72074)、拟南芥(arabidopsisthaliana)腈水解酶atnit(np851011)和高山南芥(arabisalpine)腈水解酶aanit(kfk44999)全合成该基因序列，两端设计酶切位点xhoi和xbai，克隆至空载体pet28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌bl21(de3)，培养检测阳性菌，得到重组腈水解酶基因工程菌bl21(de3)/pet28b-brnit、bl21(de3)/pet28b-brnit2、bl21(de3)/pet28b-atnit和bl21(de3)/pet28b-aanit。
实施例2构建重组酰胺酶工程菌
根据已报道的来源于pantoeasp.yr343、comamonascomposti和d.tsuruhatensiszjb-05174的酰胺酶基因pa-ami(wp_008109374)、cc-ami(wp_027015397)和dt-ami(kp943494)，对其基因序列进行全合成。设计含有ecori和ncoi位点的上下游引物，扩增基因后插入pet28b中，构建表达载体，热击转化到bl21(de3)感受态细胞中，得到酰胺酶基因工程菌bl21(de3)/pet28b-pa-ami、bl21(de3)/pet28b-cc-ami和bl21(de3)/pet28b-dt-ami。
实施例3基因工程菌的表达培养
挑取单菌落接入5ml液体lb培养基中，卡那霉素终浓度为50mg/l。培养条件为37℃，200rpm，培养6-8h。将上述种子液以2％的体积比转接至新鲜的含有终浓度为50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、150rpm培养至菌体od600约为0.6-0.8时，向上述lb液体培养基中加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg，终浓度为0.1mm)，28℃、150rpm诱导培养10-12h，收集发酵液于4℃，8000rpm的条件下离心10min，然后加入生理盐水洗涤菌体一次，将离心所得菌体置于-20℃冰箱保存，应用于以下实施例中。
实施例4重组腈水解酶催化ibsn及产物组成分析
(a)重组腈水解酶的活力及立体选择性
对实施例3中培养得到的重组腈水解酶基因工程菌进行活力和立体选择性测定，具体内容如下：
含腈水解酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10ml)：tris-hcl缓冲溶液(50mm，ph8.0)，外消旋异丁基丁二腈30g/l，湿菌体10g/l；反应液于30℃、200rpm条件下反应4h，取样500μl，加入200μl2mhcl终止反应。
结果显示腈水解酶对异丁基丁二腈(ibsn)的催化能力：brnit>aanit>brnit2>atnit，具体数据如表1所示：
表1重组腈水解酶催化ibsn水解结果
注：e意指“对映体选择率，enantiomericratio”，是表征酶立体选择性的参数。
(b)重组腈水解酶催化ibsn反应过程中产物组成分析
对重组腈水解酶催化ibsn反应产物进行气相色谱分析，结果显示除底物、产物峰外有另一色谱峰存在，如图1所示。为了确定该物质结构，对该物质进行了分离、纯化。具体步骤如下：收集反应液置于沸水中加热20min，利用减压抽滤去除截留的杂蛋白及部分底物。再加入2倍体积乙酸乙酯进行萃取，去除反应液中的底物(该步骤重复两次以确保底物有效去除)，收集下层水相并利用naoh调ph至12.0，再次加入2倍体积乙酸乙酯萃取。收集上层有机相，旋蒸后得到浅黄色油状化合物，经结构鉴定为(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺。
nmr表征结果：1hnmr(500mhz,cdcl3-d1):δ5.73(d,j＝37.8hz,2h),3.21-3.13(m,1h),2.65-2.57(m,1h),2.45(dd,j＝15.3,6.6hz,1h),1.95-1.81(m,1h),1.67-1.59(m,1h),1.39(tdd,j＝13.5,9.9,5.5hz,1h),1.02-0.95(m,6h)；13cnmr(126mhz,cdcl3-d1):δ170.77,121.60,40.80,38.49,26.23,26.02,22.93,21.25；
质谱表征结果：ms(esi):m/z155.1[m+h]+。
参照上述步骤(a)，对重组腈水解酶催化ibsn反应过程中的产物组成进行分析，结果显示腈水解酶产酰胺的能力为：brnit2>brnit>atnit>aanit，具体数据如表2所示。
表2重组腈水解酶催化ibsn反应过程产物组成
(c)重组腈水解酶催化ibsn的反应进程
据表1和表2数据结果显示，aanit对底物ibsn的立体选择性最高，且酰胺含量在产物中占比最少，因此对其催化ibsn的反应进程进行研究。将0.25g的含有腈水解酶的湿菌体bl21(de3)/pet28b-aanit加入到10mltris-hcl缓冲液(50mm，ph＝8.0)中，并加入底物ibsn0.5g。于30℃、200rpm条件下反应，每隔0.5h取样，对反应进程进行检测，反应进程如图2所示。8h后，底物ibsn转化为产物(s)-3-氰基-5-甲基己酸(记为(s)-cmha)的转化率为49.5％，e.e.为99.5％，(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺(记为(s)-cmhm，相对于目标产物，可视为副产物)含量为0.7g/l。
产物3-氰基-5-甲基己酸含量的测定：利用液相色谱(岛津lc-16)外标法测定转化液中(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的含量。色谱柱为
底物外消旋异丁基丁二腈、产物3-氰基-5-甲基己酸和3-氰基-5-甲基己酰胺的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890n(安捷伦)，毛细管柱型号为bgb-174(bgbanalytikswitzerland)。色谱条件为：进样量1.0μl，进样口、检测器温度均为250℃，柱温为170℃保持10min，10℃/min升温至200℃，保持5min。载气为高纯氦气，流速为1.0ml/min，分流比为50:1。
对映体过量值(e.e.)、转化率(c)的计算参考rakels等的计算方法(enzymemicrob.technol.,1993,15:1051)。
实施例5重组酰胺酶催化(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(a)重组酰胺酶活力的测定
对实施例3中培养得到的重组酰胺酶基因工程菌进行活力的检测，具体步骤如下所示。
含酰胺酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10ml)：tris-hcl缓冲溶液(50mm，ph8.0)，(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺30g/l，湿菌体10g/l。反应液于30℃、200rpm条件下反应30min。取样500μl，加入200μl2mhcl终止反应后，参照实施例4中的液相色谱法对转化液中的(s)-3-氰基-5-甲基己酸含量进行测定。结果如表3所示。
表3重组酰胺酶催化(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(b)酰胺酶添加量的优化
转化体系组成及操作如下：在20mltris-hcl缓冲液(ph＝8.0)中加入2g的外消旋异丁基丁二腈(ibsn)及1g的湿菌体细胞，菌体细胞为含腈水解酶brnit与含酰胺酶pa-ami的细胞混合体，且两者之间的质量比分别设为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1、12:1及15:1)，于30℃、200rpm条件下反应，反应3h后取样进行检测，检测方法参照实施例4。结果显示，在比值达到12:1、9:1、7:1及更小比值时，副产物(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺无积累。比值为15:1和不添加酰胺酶时，副产物(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺无法完全被水解，且随着酰胺酶用量的减少，积累量逐渐增加。
实施例6双酶耦联一锅法催化ibsn合成普瑞巴林关键手性中间体(s)-3-氰基-5-甲基己酸
重组基因工程菌一锅法催化ibsn合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸
合成路线图如图3所示，将100mltris-hcl缓冲液(50mm，ph＝8.0)加入到250ml的三口烧瓶中，同时加入底物ibsn8g、含腈水解酶的工程菌bl21(de3)/pet28b-brnit和含酰胺酶的工程菌bl21(de3)/pet28b-pa-ami共6g(wcw，二者质量比为5:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应4.5h，转化率达到49.0％，e.e.为99.2％，反应过程中未检测到(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累(图4)。
实施例7重组基因工程菌一锅法催化ibsn合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸
分别称取5g实施例3中获得的重组腈水解酶基因工程菌bl21(de3)/pet28b-brnit和0.6g重组酰胺酶基因工程菌bl21(de3)/pet28b-dt-ami的湿菌体，投入到含有100g/libsn的100mltris-hcl缓冲液中(50mm，ph＝8.0)，混匀并于30℃水浴反应8h，转化率达到47.5％，e.e.为99.1％，反应过程中未检测到(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成(图5)。
实施例8双酶耦联一锅法催化ibsn合成(s)-3-氰基-5-甲基己酸
将10mltris-hcl缓冲液(50mm，ph＝8.0)加入到50ml的具塞反应瓶中，同时加入底物ibsn1.2g、含腈水解酶的工程菌bl21(de3)/pet28b-brnit2和含酰胺酶的工程菌bl21(de3)/pet28b-pa-ami共0.6g(wcw，二者质量比为9:1)。加入完毕后，混匀并于30℃水浴反应10h，转化率达到49.1％，e.e.为98.7％，反应过程中未检测到(s)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成。
需要指出的是，上述实验实例仅为说明本发明的构思及特点，其目的是让熟悉本发明的人了解本实验并据以实施，并不能限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质做出的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。