酶化学法合成结构明确的硫酸肝素寡糖的方法与流程

本发明属于医药化工技术领域，具体涉及一种酶化学法合成结构明确的硫酸肝素寡糖的方法。

背景技术：

硫酸肝素(heparansulfate,hs)是线性黏多糖，具有抗凝血、抗病毒、抗炎、抗肿瘤以及调控胚胎发育等生物活性，其主要结构由己糖醛酸与氨基葡萄糖重复二糖单位组成，之间1,4-糖苷键连接，糖残基不同程度地携带磺酰基，决定硫酸肝素空间拓扑结构的不同，进而发挥不同生理作用或引发不同疾病。硫酸肝素通常存在细胞表面或细胞基质中，以不同链长不同硫酸化形式与核心蛋白缀合形式存在，天然分离纯化得到的硫酸肝素是一种混合物，且含量少，致使无法精确探讨硫酸肝素的生物机制以及总结其构效关系，严重影响硫酸肝素科学研究与药物研发进展。

经对现有技术的文献检索发现，硫酸肝素的制备主要有两类方法，化学合成法和酶化学合成法，前者通过模块构建、糖苷键的区域性和立体性的选择、保护与脱保护等等反应制备硫酸肝素，然而，该方法路线长、纯化难、产率低，超过六个糖单位的硫酸肝素制备极具挑战性，经典例子磺达肝素钠的合成，总共51步，产率仅为0.053％(肝素类单糖、二糖、三糖和戊糖的制备，美国专利，2017，us20170015695a1)。虽然近期由报道12聚硫酸肝素合成的报道，采取4个硫酸肝素重复单位耦合而成，但结构多样性差、适用范围小(四聚糖迭代合成肝素类十二糖和体内放射性标记组织分布研究，自然通讯，2013，4(7)，2016-2024)。酶化学合成天然硫酸肝素是北卡大学教堂山分校刘建教授创建的，也是现行最认可的合成硫酸肝素方法(具有可逆抗凝血活性的结构均匀的低分子量肝素，自然化学生物，2014，10：248-250.)，但因起始原料对硝基苯基β-d-葡萄糖醛酸中的对硝基苯酚存在，使得所有得到结构确定且多样化硫酸肝素含有对硝基苯酚标签，严格意义上讲，不是真正的硫酸肝素，且其对硝基苯基对硫酸肝素活性的影响是不清楚，尽管有许多科学家尝试去掉硫酸肝素上对硝基苯基(铈铵盐氧化裂解酶化学合成硫酸肝素中的对硝基苯基，四面体通讯，2013,54，4471-4474；通过对乙酰基苯基糖苷形式选择性氧化裂解寡糖端位对硝基苯酚，四面体通讯，1996，3343-3344.)，容易破坏还原端葡萄糖醛酸，总体收效甚微，很难推广应用。以取代苄基-β-d-葡萄糖醛酸苷为起始原料，酶化学方法制备所需含取代苄基的硫酸肝素衍生物，氢化催化得硫酸肝素是比较方便的，避免对硝基苯只能还原硝基无法脱苯基缺点，同时，还原时务必加大催化还原试剂的量，还原时间太短仅能生成硝基还原产物，还原时间大于15min以上，有利于硫酸肝素制备。本研究专利以取代苄基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷代替对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷为起始原料，采用酶化学方法制备各种结构确定的硫酸肝素。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种酶化学法合成硫酸肝素寡糖的方法，应用于硫酸肝素生物功能挖潜以及构效关系探讨研究。具体是采取取代苄基葡糖醛酸为起始原料，通过一系列的硫酸肝素生物合成涉及重组酶制备结构确定的硫酸肝素，为探索硫酸肝素的构效关系以及对应生物作用机制提供工具分子或探针。

本发明所述硫酸肝素是己糖醛酸与氨基葡萄糖重复二糖单位，之间由1,4-糖苷键，糖残基不同程度携带磺酰基，所述的酶合成反应条件温和，反应试剂易得，合成的结构确定且多样化硫酸肝素可以作为研究其生物功能与探讨其构效关系的工具分子或探针。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

本发明涉及一种硫酸肝素，其结构式如式i所示：

其中，r1、r2、r4分别为氢或磺酰基(so3^-)，r3为氢、乙酰基(ac-)或磺酰基(so3^-)，n为0～6中任一整数。

本发明还涉及一种本发明的硫酸肝素的酶化学合成方法，以取代苄基-β-d-葡萄糖醛酸苷为起始原料，在硫酸肝素生物合成用重组酶的作用下，合成含有取代苄基的重复二糖单位硫酸肝素衍生物其中，r5为-no3或-och3；经pd/c催化氢化脱苄基，制得所述硫酸肝素。

优选的，所述硫酸肝素生物合成用重组酶选自pmsh2,kfia,nst,ndstc5-epi,2-ost,6-ost,3-ost。

优选的，所述方法包括如下步骤：

s1、在30℃～37℃下，以取代苄基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷为起始原料，在hs聚合酶heparosansynthase-2来源pasteurellamultocida(pmsh2)或kfia催化下，与udp-活化乙酰氨基葡萄糖(udp-glcnac)或udp-活化三氟乙酰氨基葡萄糖(udp-glcntfa)、udp-活化葡萄糖醛酸(udp-glca)交替反应延长；再按目标结构要求，经n-磺酰基转移酶(n-deacetylase/n-sulfotransferase,ndst)、2-o-磺酰转移酶(2-o-sulfotransferase,2-ost)、c5-异构酶(c5-epimerase,c5-epi)、6-o-磺酰转移酶(6-o-sulfotransferase,6-ost)、3-o-磺酰转移酶(3-o-sulfotransferase,3-ost)中的一种或几种催化，制备所述含有取代苄基的重复二糖单位硫酸肝素衍生物；

s2、在氢气保护下，将所述含有取代苄基的重复二糖单位硫酸肝素衍生物溶入水中，用10％pd/c催化氢化或氧化剂氧化，30℃～37℃下搅拌15min-60min，过滤，有机溶剂萃取，离心浓缩水层，即得所述硫酸肝素。

优选的，所述步骤s2中，10％pd/c催化氢化采用的氢源为氢气或甲酸铵，催化量10wt％～50wt％；氧化剂选用二氯二腈基苯醌(ddq)、高氯酸钠中的一种或两种。

优选的，所述步骤s2中，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷等

本发明还涉及一种本发明的硫酸肝素在作为研究生命体内硫酸肝素的生物功能及构效关系的工具小分子或探针中的用途。

本发明还涉及一种本发明的硫酸肝素在制备预防或治疗因硫酸肝素异常引发的疾病药物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明方法无需像化学合成通过保护与脱保护繁琐步骤、考虑区域与立体构型选择等问题，直接通过酶催化具有特色制备结构明确且多样化的硫酸肝素，反应条件温和，路线短，产率高。

2、本发明方法保留具有制备硫酸肝素所需的分离纯化监测优势芳香标签，同时，能在pd/c氢化催化的条件下或ddq等氧化剂氧化裂解地脱去芳香标签制备各种结构明确的硫酸肝素，该脱苄基方法条件温和，与其它保护基及硫酸肝素兼容，时间短，产率高。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明的酶化学法合成硫酸肝素寡糖的路线图；

图2为以对硝基苄基葡萄糖醛酸为原料制备硫酸肝素的示例路线图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，以对硝基苄基-单糖或硫酸肝素二糖或硫酸肝素三糖糖苷为制备硫酸肝素代表性结构，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例

本发明的酶化学法合成硫酸肝素寡糖的路线如图1所示，本实施例的示例路线图如图2所示，具体包括如下步骤：

1、对硝基苄基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷1的合成

将41.6克碳酸银(151.2mmol)、11.6克(75.6mmol)对硝基苯甲醇、催化量的碘分别溶入80ml二氯甲烷，加入分子筛，搅拌10mins，溶有20克2,3,4-三-o-乙酰基-α-d-溴代-葡萄糖醛酸酯(50.4mmol)20毫升二氯甲烷缓缓加入，滴毕，用锡箔纸包裹反应24小时，加入乙酸乙酯稀释，硅藻土过滤，滤液减压浓缩，粗品硅胶柱纯化，用95％乙醇重结晶制备22.1克对硝基苄基2,3,4-o-乙酰基-β-d-葡萄糖醛酸甲酯糖苷白色固体，产率93.4％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ:8.18(d,j＝8hz,2h),7.45(d,j＝8hz,2h),5.26(t,j＝4hz,2h),5.10(t,j＝8,4hz,1h),5.02(t,j＝16hz,1h)，4.68(t,j＝16,12hz,2h),4.06(d,j＝4hz,1h)，3.73(s,3h),2.03(s,3h),2.01(s,6h).¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ:169.97,169.34,169.15,167.08,147.41,144.16,127.58,123.62,99.94,72.57,71.76,71.09,69.64,69.20,52.92,20.43.

将14.8克对硝基苄基2,3,4-o-乙酰基-β-d-葡萄糖醛酸甲酯糖苷(30mmol)溶液无水甲醇溶液中，加入3.6克氢氧化锂(150mmol)，室温搅拌4小时，tlc监控进程，dowex50wx树脂加入中和过量碱，过滤，减压浓缩得对硝基苄-β-d-葡萄糖醛酸，用乙醇重结晶得7.4克白色片状的固体，产率75％。

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.22(d,j＝8hz,2h),7.72(d,j＝8hz,2h),6.85(s,1h),5.23(t,j＝4hz,2h),5.00(t,j＝8hz,2h),4.74(d,j＝12hz,1h),4.31(d,j＝8,hz,1h),3.17-3.07(m,3h).

2、对硝基苄基硫酸肝素二糖2a合成

将329mg对硝基苄基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷(1mmol)溶于20mltris(25mm,ph7.2)缓冲液中，反应液中氯化锰浓度为5mm,然后，分别加入1.25mmoludp-glcnac和1.05mg聚合酶pmhs2,30℃反应过夜,polyii-hplc监测反应进程，c18层析柱(1.5×70cm,biotage,0～100％甲醇水溶液(含有0.1％三氟乙酸)作为流动相，流速2ml/min)纯化得二糖，离心浓缩干燥得505.4mg白色粉末,产率为95％。¹hnmr(600mhz,h2o):8.09(d,j＝6.0hz,2h),7.48(d,j＝6.0hz,2h),5.23(d,j＝3.0hz,1h),4.85(d,j＝12.0hz,1h)，4.75(d,j＝12.0hz,1h)，4.50(d,j＝6.0hz,1h)，3.95(d,j＝12.0hz,1h),3.79(dd,j＝6.0,6.0hz,1h),3.73-3.70(m,2h)，3.65-3.56(m,3h),3.50-3.42(m,2h),3.32-3.30(m,1h),1.93(s,3h).esi-ms(负离子模式),m/z:c21h28n2o14,[m-1]^-计算值531.15,测定值531.75.

3、对硝基苄基硫酸肝素三糖2b合成

将329mg对硝基苄基基-β-d-葡萄糖醛酸苷(1mmol)溶于20mltris(25mm,ph7.2)缓冲液中，反应液中氯化锰浓度为5mm,然后，分别加入1.25mmoludp-glcnac和1.05mg聚合酶pmhs2,30℃反应过夜,polyii-hplc监测反应进程，c18层析柱(1.5×70cm,biotage,0～100％甲醇水溶液(含有0.1％三氟乙酸)作为流动相，流速2ml/min)纯化得二糖，离心浓缩干燥得白色粉末直接溶于20ml含有5mm氯化锰tris缓冲溶液(25mm,ph7.2)，先后加入1.25mmol的udp-glca与聚合酶pmhs2，37℃反应过夜，经c18柱纯化后(如同二糖监测与纯化方法)得三糖，离心浓缩干燥得625.4mg白色粉末,产率为88.1％。¹hnmr(600mhz,h2o):8.08(d,j＝4hz,2h),7.48(d,j＝4hz,2h),5.21(d,j＝3.0hz,1h),4.84(d,j＝12.0hz,2h)，4.74(d,j＝12.0hz,1h)，4.49(dd,j＝6.0,6.0hz,2h)，3.95(dd,j＝8.0,3.6hz,1h),3.81-3.78(m,2h)，3.72-3.66(m,3h),3.65-3.55(m,3h),3.53-3.41(m,2h),3.30-3.25(m,2h),1.92(s,3h).(以对硝基苯基-β-d-葡萄糖醛酸苷计算)。esi-ms(负离子模式),m/z:c27h36n2o20,[m-1]^-,计算值707.18,测定值707.75.

4、葡萄糖醛酸(3a)的合成

将329mg对硝基苄基-β-d-葡萄糖醛酸糖苷(1mmol，1)溶于双重蒸馏水中，加入40mg10％pd/c,通入氢气催化，脱对硝苄基，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，水层离心浓缩得194mg化合物3a,产率为100％。

¹cnmr(100mhz,d2o):174.2,96.6,75.1,74.5,73.6,71.3.esi-ms(负离子模式),m/z:c6h10o7,计算值193.04,测定值193.04.52

5、硫酸肝素二糖3b的合成

将53.2mg对硝基苄基硫酸肝素二糖(0.1mmol，2a)溶于双重蒸馏水中，加入10mg10％pd/c,通入氢气催化，脱对硝苄基，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，水层离心浓缩得38.4mg硫酸肝素二糖3b,产率为96.％。esi-ms(负离子模式),m/z:计算值c14h23no12,[m-1]^-,计算值396.11,测定值396.47.

6、硫酸肝素三糖3c的合成

将70.8mg对硝基苄基硫酸肝素三糖(0.1mmol,2b)溶于双重蒸馏水中，加入10mg10％pd/c,通入氢气催化，脱对硝苄基，硅藻土过滤，乙酸乙酯萃取，水层离心浓缩得55.4mg硫酸肝素三糖3c,产率为96.9％。esi-ms(负离子模式),m/z:计算值c20h31no18[m-1]^-,计算值572.14,测定值572.36.

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。