本发明涉及一种制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的方法，属于甜味剂的生物合成技术领域。
背景技术：
甜菊糖苷是甜叶菊提取物中约40种糖苷分子的总称，均由具有甜味的亲水性糖基与疏水性的甜菊醇苷元组成。其中rebaudiosided和rebaudiosidem的味质口感较好，莱鲍迪苷a(rebaudiosidea，ra)口感较好但甜味略嫌持久，而斯替夫苷(stevioside，st)、莱鲍迪苷c和其它低分子量甜菊糖苷则带有一定的轻微苦味或甘草余味，这种微苦余味降低了它作为天然甜味剂的品质。除了具有苦味的杂质对甜菊糖苷产品口感味质有影响外，甜菊糖苷自身的甜菊醇苷元分子结构也是产生苦涩余味和后甜(即甜味持久)的因素。而从味觉角度的生物学来看，不同甜菊糖苷与甜味受体和苦味受体的结合能差异是一个重要因素。
对甜菊糖苷口感进行改善的方法之一是利用酶法糖基化等方法引入糖基，利用接入糖基的空间位阻，改变甜菊糖苷与甜味受体和苦味受体的结合能差异，对其口感味质进行改善。但酶法糖基化会得到很多种无规的转糖基产物，典型的如各种葡萄糖基取代数或称接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷，产品中接枝数从1到20。葡萄糖基甜菊糖苷分子中，低接枝数产品如单和二葡萄糖基接枝的甜菊糖苷的质量百分数总计通常低于总苷的50％。所有葡萄糖基甜菊糖苷的甜度都会比原料甜菊糖苷的甜度有不同程度的降低，后味即口感也会有所改善。葡萄糖基取代数高的产品，可以用作矫味剂和餐桌糖，但甜度下降过多。葡萄糖基取代数低的产品，如甜菊糖苷的单和二葡萄糖基取代物，其甜度和矫味功能均较好；其结构同于天然甜菊糖中味质最好的rd和rm的同分异构体。
一种利用酶法糖基化等方法引入糖基对甜菊糖苷口感进行改善的方法，是采用来自嗜碱软性芽胞杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶催化甜菊苷st的转苷，得到9种产物，结构分析显示在c-13位和c-19位通过α-1,4糖苷键分别连接了1到3个葡萄糖基，而c-13位连接1个或2个葡萄糖基时，味质与st相比都已改善；当c-13位连接3个葡萄糖基时，甜度则大幅下降(fukunaga,1989)。lobov等利用普鲁兰酶(pullulanase)和真菌淀粉酶(biozymel)，用于甜菊糖苷的转苷反应，分别得到三种产物；但反应所需时间较长且产物收率小于10％(lobov,1991)。abelyan用环糊精作为糖基供体，得到九种转糖基产物，其中两种葡萄糖基甜菊糖苷的甜味特性较好，但产率较低，产率之和为11.6％(abelyanva,2004)。kochikyan用六种菌株生产出不同种类的环糊精葡萄糖基转移酶，以液化淀粉作为糖基供体催化甜菊糖苷转苷，得到七种转糖基产物(kochikyanvt,2006)。
另一种对甜菊糖苷口感进行改善的方法，是用α-环糊精葡萄糖基转移酶toruzyme3.0l和α-中温淀粉酶双酶法催化水解淀粉改性st，反应4h，st转化率达到77.11％，得到十四种甜菊糖苷衍生物；产物的后苦涩味明显改善，口感清甜。甜度最高的st-glc1和st-glc2的产率最高。以环糊精和斯替夫苷为底物，以10u/g斯替夫苷的加酶量，反应5h后斯替夫苷的转化率最高可达到87.8％(liw,2013)。
美国专利us4219571和us7807206利用嗜热脂肪芽孢杆菌产的环糊精葡萄糖基转移酶，得到具有高达10的聚合度的α-1,4葡糖基衍生物。
中国专利cn105899670a将淀粉酶和环糊精葡萄糖基转移酶的混合物加入到淀粉悬浮液中并在约75-80℃下孵育约0.5至2小时，生成液化淀粉悬浮液后通过低ph热处理将淀粉酶灭活；然后将甜菊醇糖苷加入到液化淀粉悬浮液中，生成反应混合物，再将第二批环糊精葡萄糖基转移酶加入到反应混合物中并在约5-125℃下孵育约1至168小时；随后加入一种或几种糖酶，将反应混合物在约5-125℃下孵育约0.0001-168小时，所得葡萄糖基甜菊糖苷组合物包含具有二十个或更少的α-1，4-葡糖基残基的甜菊醇糖苷衍生物。所得到的产品使用离子交换树脂或膜进行脱色；再将脱色后的反应混合物与大孔吸附树脂接触来除去非甜菊糖苷化合物并随后用醇或含水醇洗脱吸附的甜菊糖苷；将洗脱液通过填充有离子交换树脂的柱或膜来进行脱盐；从洗脱液中除去醇，获得含水洗脱液；将含水洗脱液浓缩并干燥以获得干燥的葡萄糖基甜菊糖苷。
综上所述，需要提供一种简便的制备方法来获得以低接枝数为主的葡萄糖基甜菊糖苷，即单和二取代葡萄糖基甜菊糖苷的质量含量超过50％的产品，这样可以兼顾产品甜度和矫味功能。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对以上现状的不足，提供一种简单、经济的方法以制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷，即产品中甜菊糖苷的单和二葡萄糖基取代物含量为总苷的60％以上，葡萄糖基接枝数小于等于3的葡萄糖基甜菊糖苷的质量百分数总计高于总苷的70％；所述总苷指葡萄糖基甜菊糖苷和甜菊糖苷。
具体地，用淀粉酶催化水解高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷以制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。产品经直接喷雾干燥或者稍经浓缩并干燥即得葡萄糖基甜菊糖苷粗产品，可以用重结晶脱去副产品还原糖，还可以将副产品还原糖等经大孔吸附树脂吸附后用水洗脱。
所述原料高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷分子中接枝数大于等于4的葡萄糖基甜菊糖苷的质量百分数总计高于总苷(即所有甜菊糖苷，包括葡萄糖基甜菊糖苷和甜菊糖苷)总质量的40％(hplc法测定)，或者，所述原料高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷分子中单葡萄糖基接枝的甜菊糖苷和二葡萄糖基接枝的甜菊糖苷的质量百分数总计低于总苷的50％(hplc法测定)，是本领域技术人员公知的商业化产品。
所述原料高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷是酶促转糖基法的产物，所述酶是环糊精葡萄糖基转移酶。
所述淀粉酶来源于黑曲霉(aspergillusnigersp.)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、米根霉(rhizopusoryzae)或米曲霉(aspergillusoryzae)，符合gb2760-2014的商业化产品。
在本发明一种实施方式中，以来源于枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶为催化剂，以60～300g/l的高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷为底物，在55～60℃条件下反应3～5h。所述α-淀粉酶的用量可以是1000～4000u/g。
在本发明一种实施方式中，以来源于黑曲霉的糖化酶为催化剂，以60～240g/l的高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷为底物，在55～60℃条件下反应3～24h。所述底物浓度优选60～240g/l。所述糖化酶的用量优选50～800u/g。
在本发明一种实施方式中，以来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶为催化剂，以60～240g/l的高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷为底物，在55～60℃条件下反应3～24h。所述底物浓度优选60g/l。所述α-淀粉酶的用量优选50～800u/g。
在本发明一种实施方式中，以来源于枯草芽孢杆菌的β-淀粉酶为催化剂，以60～240g/l的高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷为底物，在55～60℃条件下反应3～24h。所述底物浓度优选60g/l。所述β-淀粉酶的用量优选50～800u/g。
[有益效果]
本发明公开的一种制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的方法，采用单酶，以高接枝数的葡萄糖基甜菊糖苷为底物，反应时间短，工艺简洁，可以高通量得到甜味和口感俱佳的组成相对简单、低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。
目前市场上最欢迎的甜菊醇糖苷是rd和rm，即分别为ra在c19位的单和二取代葡萄糖基产品。本发明酶催化所得的单和二取代葡萄糖基甜菊糖苷在结构上与之类似，属于其同分异构体的混合物，甜度和矫味功能均较好。
附图说明
图1枯草芽孢杆菌α-淀粉酶(4000u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图2黑曲霉糖化酶(50u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图3黑曲霉糖化酶(100u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图4黑曲霉糖化酶(300u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图5解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(800u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图6地衣芽孢杆菌β-淀粉酶(300u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图7地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(300u/g糖)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。图8黑曲霉糖化酶(50u/g糖，60℃)催化水解葡萄糖基甜菊糖苷的hplc图。
图9底物浓度对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响。
图10ph对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响。
图11加酶量对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响。
具体实施方式
分析计算方法：
(1)葡萄糖基甜菊糖苷的定性分析：采用液相色谱串联四极杆飞行时间质谱仪定性转苷产物，检测条件如下：acquityuplcbehhilic氨基色谱柱，柱温为30℃，乙腈：水＝80：20,(2min)-50：50(30min)(v/v)下梯度洗脱，进样量1μl，进样浓度为5mg/ml，流速为0.3ml/min；质谱条件为碰撞电压为6ev；离子化方式电喷雾电离(esi)，负离子检测模式，分子量范围：200-2000。
(2)葡萄糖基甜菊糖苷的定量分析依据gb2760-2014卫计委增补文件第8号文件中葡萄糖基甜菊糖苷的分析检测方法。
(3)糖化酶酶活、α-淀粉酶酶活用国标gb1886.174—2016中酶活测定方法测定。
实施例1以源于bacillussubtilis的α-淀粉酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
用源于莱苞迪苷a的葡萄糖基甜菊糖苷为原料制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。该原料是以莱苞迪苷a为原料和糊精在环糊精葡萄糖转移酶的催化下转苷得到的商品。原料中莱苞迪苷a的质量分数为8.3％，单、二取代物(单葡萄糖基接枝的甜菊糖苷和二葡萄糖基接枝的甜菊糖苷)的质量分数共计23.3％。
在夹套反应器中加入20g水，加热到60℃后先后投入1.2g原料糖苷，搅拌溶解后，搅拌条件下向上述夹套反应器中按4000u/g原料加入来源于bacillussubtilis的α-淀粉酶(无锡雪梅酶制剂厂出品)水溶液。60℃下反应5h，结束反应。产品中总苷含量为98.7％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为36.8％和34.4％，共占71.2％；单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占86.1％，甜度和矫味功能均较好。水解后产品的高压液相图见说明书附图1。
实施例2以来源于aspergillussp.的糖化酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
用源于莱苞迪苷a的葡萄糖基甜菊糖苷为原料制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。原料中莱苞迪苷a的质量分数为9.8％，单、二取代物的质量分数共占30.5％。
在夹套反应器中加入20g水，加热到55℃后投入4.8g原料糖苷，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按50u/g原料糖苷加入来源于aspergillussp.的糖化酶(山东西亚化学工业有限公司出品)水溶液。55℃下反应7.5h，结束反应。产品中总苷含量为99.4％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为43.9％和25.9％，共占69.8％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占76.3％，甜度和矫味功能均较好。水解后产品的高压液相图见说明书附图2。
实施例3以来源于aspergillussp.的糖化酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
用源于莱苞迪苷a的葡萄糖基甜菊糖苷为原料制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。原料中莱苞迪苷a的质量分数为9.8％，单、二取代物的质量分数共占30.5％。
在夹套反应器中加入20g水，加热到55℃后投入1.2g原料糖苷，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按100u/g原料糖苷加入来源于aspergillussp.的糖化酶水溶液。55℃下反应2.5h，结束反应。产品中总苷含量98.0％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为40.2％和25.3％，共占65.5％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量占75.6％，甜度和矫味功能均较好。水解后产品的高压液相图见说明书附图3。
实施例4以源于aspergillussp.的糖化酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
用源于莱苞迪苷a的葡萄糖基甜菊糖苷为原料制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。原料中莱苞迪苷a的质量分数为6.8％，单、二取代物的质量分数共占21.2％。
在夹套反应器中加入20g水，加热到55℃后投入1.2g原料糖苷，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按300u/g原料糖苷加入来源于aspergillussp.的糖化酶水溶液。55℃下反应0.5h，结束反应。产品中总苷含量为99.0％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为36.5％和28.9％，共占65.4％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占80.2％，甜度和矫味功能均较好。水解后产品的高压液相图见说明书附图4。
实施例5以来源于bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
以莱苞迪苷a的质量分数为8.3％，单、二取代物的质量分数共占23.3％的葡萄糖基甜菊糖苷为原料，制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。
在夹套反应器中加入20g水，加热到60℃后先后投入1.2g糖，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按800u/g原料糖苷加入来源于bacillusamyloliquefaciens的α-淀粉酶水溶液。60℃下反应24h，结束反应。产品中总苷含量为99.0％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为33.7％和34.0％，共占67.7％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占85.1％，甜度和矫味功能均较好。水解后产品的高压液相图见说明书附图5。
实施例6以源于bacilluslicheniformis的β-淀粉酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
以莱苞迪苷a的含量为9.1％，单、二取代物共占23.7％的葡萄糖基甜菊糖苷为原料，制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。
在夹套反应器中加入20g水，加热到60℃后先后投入4g糖，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按300u/g原料糖苷加入bacilluslicheniformisβ-淀粉酶水溶液。60℃下反应3h，结束反应。产品中总苷含量为92.4％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为33.3％和27.2％，共占60.5％，甜度和矫味功能均较好。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占71.7％。水解后产品的高压液相图见说明书附图6。
实施例7以源于bacilluslicheniformis的α-淀粉酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
以莱苞迪苷a的含量为8.3％，单、二取代物共占23.3％的葡萄糖基甜菊糖苷为原料，制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。
在夹套反应器中加入20g水，加热到85℃后先后投入6g糖，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按300u/g原料糖苷加入bacilluslicheniformisα-淀粉酶水溶液。85℃下反应3h，结束反应。产品中总苷含量为95.6％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为37.7％和25.9％，共占63.6％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占71.6％。水解后产品的高压液相图见说明书附图7。
实施例8以源于aspergillussp.的糖化酶为催化剂合成低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷
以莱苞迪苷a的含量为9.8％，单、二取代物共占30.5％的葡萄糖基甜菊糖苷为原料，制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷。
在夹套反应器中加入20g水，加热到60℃后先后投入5g糖，搅拌溶解后，搅拌下向上述夹套反应器中按50u/g原料糖苷加入aspergillussp.的糖化酶水溶液。60℃下反应7h，结束反应。产品中总苷含量为96.1％，单、二取代葡萄糖基甜菊糖苷的含量分别为47.6％和15.3％，共占62.9％。单、双、三取代葡萄糖基甜菊糖苷含量共占71.9％。水解后产品的高压液相图见说明书附图8。
实施例9原料糖苷浓度对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响
60℃下分别将原料糖苷配制成100g/l、150g/l和200g/l的浓度反应，搅拌下向上述溶液中按300u/g原料糖苷加入来源于bacillussubtilis的α-淀粉酶水溶液。60℃下反应不同时间后测定产品中各种甜菊糖苷的含量，结果见说明书附图9。
由图9可以看出，实验范围内底物浓度的升高对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷没有显著影响；当然，影响程度可能会因淀粉酶品种而异的。随着反应时间的延长，一定范围内，高接枝数的产物浓度迅速降低，而低接枝数物的浓度迅速升高。
实施例10ph对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响
60℃下分别用不同ph的磷酸二氢钠—磷酸氢二钠缓冲液(10mmol/l)将原料糖苷配制成100g/l的浓度反应，搅拌下向上述溶液中按300u/g原料糖苷加入来源于bacillussubtilis的α-淀粉酶水溶液。60℃下反应不同时间后测定产品中各种甜菊糖苷的含量，结果见说明书附图10。
实施例11加酶量对制备低接枝数葡萄糖基甜菊糖苷的影响
70℃下分别用水将原料糖苷配制成100g/l的浓度反应，搅拌下向上述溶液中按300u/g原料糖苷加入来源于bacillussubtilis的α-淀粉酶水溶液。70℃下反应不同时间后测定产品中各种甜菊糖苷的含量，结果见说明书附图11。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。