本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌制备细菌素的方法。
背景技术：
芽孢杆菌，g+菌，0.7-0.8μm×1.0-1.5μm，为直或近直的杆状菌体，多数运动，鞭毛侧生，严格好氧或兼性厌氧。异养，好氧代谢、发酵代谢或二者兼有，部分可还原硝酸盐，多数产过氧化氢酶。部分芽孢杆菌可以产生多种消化酶、细菌素、抗生素等益生物质，并且安全无毒，这是其作为益生菌的先决条件。细菌素抗菌作用速度快、无毒副作用、无药物残留、不易使敏感菌产生耐受性。纤维素酶能将饲料中的纤维素部分转化为糖类，纤维素酶可以丰富消化道内酶的种类，提高动物的生产性能。
在我国农业部公布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中细菌素还未被批准作为饲料添加剂使用。枯草芽孢杆菌作为一种易培养的安全的益生菌，其所产纤维素酶并未批准被使用。
相关文献中报道的产细菌素细菌培养基lb,培养基配方：胰蛋白胨10g/l，酵母浸出物5g/l，nacl10g/l。枯草芽孢杆菌利用该种培养基产生细菌素量少，抑菌效果不明显。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用枯草芽孢杆菌制备细菌素的方法。
为实现上述目的，本发明所设计一种利用枯草芽孢杆菌制备细菌素的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接于la固体培养基上培养，得到单菌落；
2)种子液制备：将挑取单菌落接种于lb液体培养基中培养，至菌株对数生长中期，得到种子液；
3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中培养发酵，得到发酵液，其中，种子液的接种量为0.5～2％(v/v)；
4)细菌素粗提：微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为30％，沉淀培养液，离心再用pbs溶解沉淀，得到细菌素粗提液；
5)对细菌素粗提液进行冷冻干燥，得到细菌素。
进一步地，所述步骤1)中，培养条件：
培养温度为30～37℃，时间为12～24h；
la固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，琼脂15g/l。
再进一步地，所述步骤2)中，培养条件：
培养温度为30～37℃、时间为5～24h、摇床转速为150～220r/min；
lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l。
再进一步地，所述步骤3)中，培养条件：
培养温度为30～37℃，摇床转速为150～220r/min、时间为12～24h、产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l。
本发明的有益效果：
本发明制得的细菌素在4℃条件下可以长期存放，在存放30天后，抗菌效价与最初制备时无显著差异。其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠氏伤寒沙门氏菌、猪链球菌有明显的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
利用枯草芽孢杆菌制备细菌素1的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接于la固体培养基上，在培养温度为37℃条件下培养16h，得到单菌落；其中，la固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，琼脂15g/l；
2)种子液制备：将挑取单菌落接种于lb液体培养基中，在培养温度为37℃、摇床转速为200r/min；条件下培养9h，，至菌株对数生长中期，得到种子液；其中，lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中，摇瓶装液量300ml/500ml，在培养温度为37℃、摇床转速为200r/min条件下培养发酵时间为18h，得到发酵液，其中，种子液的接种量为1％(v/v)；其中，产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
4)细菌素粗提：利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为30％，沉淀培养液，在温度为4℃条件下沉淀4h，10000r/min离心，再用pbs溶解沉淀，得到细菌素粗提液；
5)对细菌素粗提液进行冷冻干燥，得到细菌素1。
实施例2
利用枯草芽孢杆菌制备细菌素2的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接于la固体培养基上，在培养温度为30℃条件下培养20h，得到单菌落；其中，la固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，琼脂15g/l；
2)种子液制备：将挑取单菌落接种于lb液体培养基中，在培养温度为30℃、摇床转速为200r/min；条件下培养10h，，至菌株对数生长中期，得到种子液；其中，lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中，摇瓶装液量300ml/500ml，在培养温度为30℃、摇床转速为200r/min条件下培养发酵时间为12h，得到发酵液，其中，种子液的接种量为2％(v/v)；其中，产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
4)细菌素粗提：利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为30％，沉淀培养液，在温度为4℃条件下沉淀4h，10000r/min离心，再用pbs溶解沉淀，得到细菌素粗提液；
5)对细菌素粗提液进行冷冻干燥，得到细菌素2。
实施例3
利用枯草芽孢杆菌制备细菌素3的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将枯草芽孢杆菌接于la固体培养基上，在培养温度为34℃条件下培养24h，得到单菌落；其中，la固体培养基的浓度组成为：胰蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，琼脂15g/l；
2)种子液制备：将挑取单菌落接种于lb液体培养基中，在培养温度为34℃、摇床转速为220r/min；条件下培养24h，，至菌株对数生长中期，得到种子液；其中，lb液体培养基配方：胰蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
3)液体摇瓶发酵：将种子液接入灭菌后的产细菌素培养基中，摇瓶装液量300ml/500ml，在培养温度为34℃、摇床转速为220r/min条件下培养发酵时间为24h，得到发酵液，其中，种子液的接种量为0.5％(v/v)；其中，产细菌素培养基配方：蛋白胨10g/l、酵母浸出物5g/l、nacl10g/l；
4)细菌素粗提：利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体，添加硫酸铵使发酵液饱和度为30％，沉淀培养液，在温度为4℃条件下沉淀4h，10000r/min离心，再用pbs溶解沉淀，得到细菌素粗提液；
5)对细菌素粗提液进行冷冻干燥，得到细菌素3。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。