本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种微生物发酵将大黄素转化为大黄酸的制备工艺。
背景技术：
大黄酸是中药芦荟、大黄等的主要有效成分，属单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，含有2个羟基和1个羧基，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降糖调脂、保肝抗纤维化等多方面具有活性。本发明提供一种利用微生物发酵技术将大黄素转化为大黄酸的制备工艺。
技术实现要素：
本发明提供一种大黄酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入发酵培养基中，于26～28℃静置培养14-20天，得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调ph至3-5，过滤收集沉淀并将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调ph至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸。
步骤(1)中，耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01为在大黄素浓度为4mg/ml时仍可稳定生长并传代的菌株；该菌株是以大黄素为诱导药物，以保藏编号：cgmccno.12762的海洋真菌青霉penicilliumsp.hk1-6为诱导对象，制备得到的；每升种子培养基的配方如下：葡萄糖20g/l、酵母膏2g/l、蛋白胨2g/l、粗海盐2.5g/l、碳酸钠5g/l，余量为水；
步骤(2)中每升发酵培养基的配方如下：葡萄糖20g/l、酵母膏2g/l、蛋白胨2g/l、粗海盐2.5g/l、碳酸钠5g/l、大黄素1-2g，余量为水。
本发明的另一实施方案提供上述耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01的制备方法，以保藏编号：cgmccno.12762的海洋真菌青霉penicilliumsp.hk1-6为诱导对象，以大黄素为诱导药物，以小剂量浓度递增法制备；其特征在于包括如下步骤：
在培养基中加入1.0μg/ml的大黄素，接种保藏编号：cgmccno.12762的菌株，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄素浓度为10μg/ml的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄素浓度为20μg/ml的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，重复上述操作，所用培养基中的大黄素浓度依次增加至50、100、200、500、1000、2000、3000、4000μg/ml，直至筛选出可以在4mg/ml浓度下，可正常生长并稳定传代的菌株，即为耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01。
本发明的另一实施方案提供上述耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01在制备大黄酸中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过使用大黄素对真菌cgmccno.12762进行诱导，得到耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01，该菌株可以将大黄素转化为大黄酸，转化操作简便且转化率高。
具体实施方式
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
以保藏编号：cgmccno.12762的海洋真菌青霉penicilliumsp.hk1-6为诱导对象，以大黄素为诱导药物，以小剂量浓度递增法制备耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01。
在培养基中加入1.0μg/ml的大黄素，接种保藏编号：cgmccno.12762的菌株，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄素浓度为10μg/ml的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，然后将该菌株接种在含大黄素浓度为20μg/ml的培养基中，挑选可正常生长并稳定传代的菌株，重复上述操作，所用培养基中的大黄素浓度依次增加至50、100、200、500、1000、2000、3000、4000μg/ml，直至筛选出可以在4mg/ml浓度下，可正常生长并稳定传代的菌株，即为耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01；每升培养基的配方为：葡萄糖20g/l、酵母膏2g/l、蛋白胨2g/l、粗海盐2.5g/l、碳酸钠5g/l、余量为水。
实施例2
(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0l，平均分装于10个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄素50g、水50l，平均分装于100个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养14天，得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调ph至3-5，过滤收集沉淀将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调ph至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸(46.62g，转化率达88.6％，hplc纯度98.7％，1hnmr和ms数据与已知报道一致)。
实施例3
(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0l，平均分装于10个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄素100g、水50l，平均分装于100个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养20天，得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调ph至3-5，过滤收集沉淀将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调ph至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸(90.05g，转化率达85.6％，hplc纯度98.3％，1hnmr和ms数据与已知报道一致)。
实施例4
(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0l，平均分装于10个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将未经大黄素诱导的菌(保藏编号：cgmccno.12762的海洋真菌青霉penicilliumsp.hk1-6)接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄素50g、水50l，平均分装于100个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养，2天后发现该真菌的生长受到抑制，无法正常生长。
实施例5
(1)配置种子培养基：葡萄糖120g、酵母膏12g、蛋白胨12g、粗海盐15g、碳酸钠30g、水6.0l，平均分装于10个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
将耐大黄素菌株penicilliumsp.r-01接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
(2)配制发酵培养基：葡萄糖1.0kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g、碳酸钠250g、大黄素200g、水50l，平均分装于100个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养20天，得发酵物；
(3)将步骤(2)得到的发酵物过滤，收集滤液，调ph至3-5，过滤收集沉淀将沉淀置于饱和碳酸氢钠溶液中，搅拌5-10min后，过滤收集滤液，调ph至3-5后过滤，沉淀经水洗、无水乙醇洗，真空干燥后即得大黄酸(24.68g，转化率达11.7％，hplc纯度97.3％，1hnmr和ms数据与已知报道一致)。