本申请涉及生物制品领域，具体地涉及一种灰星鲨混合型多肽及其制备方法，以及灰星鲨混合型多肽在作为化妆品美白剂、抗氧化剂和保湿剂等其他用途中的应用。
背景技术：
鱼皮中含有大量的胶原蛋白，胶原蛋白肽是一种新型胶原蛋白类产品，是以胶原蛋白或富含胶原蛋白的物质为原料进行生产的。它是胶原蛋白在一定的外部条件下发生“水解”反应后得到的产物。所谓外部条件就是：“胶原蛋白”这一稳定的三螺旋体在化学作用或在细菌、酶的作用下，发生分子链解体、断裂、在经过加工所得到的一种产物。它既具有胶原蛋白的特有氨基酸组成，又具有分子量小的特点。因此，它更容易透过表皮被真皮吸收，也容易通过消化道被消化，在日化、食品保健领域具有很好的用途。
关于胶原蛋白肽的制备，目前多以淡水鱼类的皮、鳞、骨或猪、牛、羊等哺乳动物的皮和骨来源酶解处理获得胶原蛋白肽。
关于混合型蛋白肽的制备鲜有报道，而以深海鲨鱼皮为原料的混合型蛋白肽更是少见报道。鲨鱼作为地球上一大类海洋生物，其经历了久远的进化过程，具有活化石的称号。目前对鲨鱼皮的开发利用还处于工业皮革的制作和食品加工的水平，对其开发尚不完全。在现有的鲨鱼皮处理方法中，需要先从鲨鱼皮中提取出胶原蛋白，然后再对胶原蛋白进行酶解，接着采用盐析、透析或色谱分离等方法进行分离，减少了氨基酸和各种微量元素的种类，导致工艺路线长，操作复杂，成本高昂，不适合大规模生产。因此对鲨鱼皮混合型多肽及其制备工艺的开发和应用将成为海洋资源开发利用的创新点，同时会产生巨大的经济效益和社会效益。
技术实现要素：
本发明公开了一种灰星鲨混合型多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)将新鲜或冻存解冻后的灰星鲨鱼皮用醇类溶液去除脂肪，用水反复漂洗干净，沥干；
(2)用沸水浴浸烫处理步骤(1)得到的灰星鲨鱼皮；
(3)将沸水浴浸烫处理后的灰星鲨鱼皮进行匀浆处理，然后用蛋白酶酶处理，得到酶解液；
(4)将所述酶解液进行离心处理，取上清液，将上清液过滤，去除滤液中的溶剂，干燥，得到灰星鲨混合型多肽。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(1)中，所述醇类溶液为乙醇、异丙醇、正丁醇中的一种或多种有机溶剂的水溶液；优选地，所述醇类溶液的浓度为10～15wt％。醇类溶液浓度太大会导致挥发性太强，刺激性太大，成本高，效果也没有明显提升。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(1)中，所述水为超滤水。对灰星鲨混合型多肽的制备而言，超滤水更加干净，而自来水等其他水杂质较多，不利于后续制备得到的产品的品质。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(1)中，所述灰星鲨鱼皮被切成1cm×1cm大小的方块。将鱼皮去除脂肪的操作具体为：用10～15wt％醇类溶液浸泡24～48h，温度为0-10℃，间隔8～12h换液一次。优选地，以ml/g计，所述醇类溶液的用量为所述灰星鲨鱼皮重量(湿重)的15～25倍体积。灰星鲨鱼皮去除脂肪后，用超滤水反复漂洗至将醇类溶液清洗干净，沥干。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(2)中，所述超滤水沸水浴(温度为常压下的100℃)浸烫处理灰星鲨鱼皮的时间是20-40分钟；优选地，以ml/g计，所述超滤水的用量为所述灰星鲨鱼皮重量(湿重)的15～25倍体积。采用沸水处理可以使蛋白质变性解链，有利于后续的酶解，并且用用沸水浴可以使组织受热更加均匀。从效率上，采用常压下约100℃的沸水温度可以减少工业生产能耗。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法步骤(3)中，所述其中所述蛋白酶选自曲酸酸性蛋白酶、舒替兰碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰酶中的一种或多种，优选为木瓜蛋白酶。在蛋白酶为木瓜蛋白酶的情况下，所述木瓜蛋白酶的用量(重量)与所述灰星鲨鱼皮重量(湿重)之比为1～5％，更优选为4±0.5％。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法步骤(3)中，以dpph(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除率和frap(铁离子还原/抗氧化能力)为指标最优的情况下得到木瓜蛋白酶处理的最佳条件，木瓜蛋白酶的最佳酶解的条件为：在ph为5.0±0.5、在50±0.5℃的温度下水解3.5±0.3h，并且以灰星鲨鱼皮重量(湿重)计，木瓜蛋白酶的添加量为4±0.5％。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法步骤(4)中，所述离心处理的离心速度为8000～12000rpm，离心时间为20～30min。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(4)中，过滤时，上清液用300目的滤网过滤。
在上述灰星鲨混合型多肽的制备方法的步骤(4)中，所述干燥为冷冻干燥或喷雾干燥，优选冷冻干燥。
本发明还公开了一种灰星鲨混合型多肽，其平均分子量小于1kda。优选地，所述灰星鲨混合型多肽由上述灰星鲨鱼皮多肽的制备方法制备而得。
由本发明制备方法得到的混合多肽的分子量小于1kd，说明该混合多肽的肽链很短，仅由几个氨基酸组成。肽分子越小，细胞吸收效果越好。美白抗氧化的原因主要是氨基酸肽的组成抑制了酪氨酸酶、过氧化物酶的活性，防止细胞产生过多的黑色素和过氧化物。过氧化物含量过高会导致细胞衰老和凋亡。
本发明还公开了一种用于化妆品的美白添加剂、抗氧化剂和保湿剂，所述美白添加剂、抗氧化剂和保湿剂包含以上所述的灰星鲨混合型多肽。
本发明还公开了以上所述的灰星鲨混合型多肽在作为化妆品中的美白添加剂、抗氧化剂和保湿剂中的应用。
鲨鱼皮含有丰富的胶原蛋白，通过现代酶学的生物技术适当的方法处理后，能获得优质的富含胶原蛋白和其他蛋白的混合型多肽。
根据现在的胶原蛋白的工艺和常规思维定式，技术人员普遍认为，胶原蛋白是具有主要美白功效的蛋白，所以在目前的化妆品工艺生产中，主要提取胶原蛋白。但是由于胶原蛋白的水溶性很差，所以多以提取胶原多肽为主。如果只一味地提取胶原蛋白，会人为的剔除掉某些可能具有其他功能性的多肽。
本申请公开的灰星鲨混合型多肽的制备方法，不同于以往处理原材料的复杂工序，而是跳过了从原料中提取胶原蛋白的工艺，直接对原料进行处理，同时保留了富含多种氨基酸和微量元素的其他蛋白质，获得了功效良好的优质混合型多肽，达到了简化制备工艺，优化产品的目的。申请人跳脱了这个思维圈子，简化了工艺，保留了其他蛋白种类，丰富了多肽的成分，制备混合型多肽提高了得率，对大规模工业生产意义非凡。混合型的多肽营养丰富，多肽种类丰富，其中可能会含有灰星鲨鲨鱼独有的一些蛋白成分，扩展了混合型多肽的功能研究。
本申请制备的灰星鲨混合型多肽不仅可以提高鲨鱼生产加工的附加值，还可以充分利用生物资源，减少海洋资源的浪费，同时可减少环境污染，获得良好的社会效益和经济效益。实验表明，本申请的灰星鲨混合型多肽在抗氧化、体外保湿、美白这三方面有显著效果。在以小鼠b16f10黑色素瘤细胞为产黑色素建模细胞的实验中，本申请的灰星鲨混合型多肽对细胞产黑色素能力有抑制作用，对细胞内黑色素的清除具有很好的效果。本申请的灰星鲨混合型多肽，在体外对酪氨酸酶有良好的抑制效果，并且能有效增加以dpph自由基清除率和frap，说明具有很好的美白及抗氧化功效。此外，本申请的灰星鲨混合型多肽经小鼠亚急性毒理实验证明无毒副作用。本申请的灰星鲨混合型多肽富含多种氨基酸、人体所需的微量元素，并且重金属含量符合国家标准。
附图说明
图1显示以dpph自由基清除率为指标，不同蛋白酶在最优酶解条件下对dpph自由基清除率的影响；
图2显示以frap为指标，不同蛋白酶在最优酶解条件下对frap的影响；
图3显示以dpph自由基清除率为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解ph条件下对dpph自由基清除率的影响；
图4显示以frap为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解ph条件下对frap的影响；
图5显示以dpph自由基清除率为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解温度条件下对dpph自由基清除率的影响；
图6显示以frap为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解温度条件下对frap的影响；
图7显示以dpph自由基清除率为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解时间条件下对dpph自由基清除率的影响；
图8显示以frap为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解时间条件下对frap的影响；
图9显示以dpph自由基清除率为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解酶量条件下对dpph自由基清除率的影响；
图10显示以frap为指标，木瓜蛋白酶在不同酶解酶量条件下对frap的影响；
图11显示以frap为指标的木瓜蛋白酶的响应面分析图，图中，x1＝a：时间，x2＝d：温度；
图12显示以frap为指标的木瓜蛋白酶的响应面分析图，图中，x1＝a：时间，x2＝c：ph；
图13显示以frap为指标的木瓜蛋白酶的响应面分析图，图中，x1＝b：酶量，x2＝c：ph；
图14显示本申请的灰星鲨混合型多肽的qexactivehplc-ms/ms图谱；
图15显示本申请的灰星鲨混合型多肽的qexactivehplc-ms/ms图谱；
图16显示本申请的灰星鲨混合型多肽的qexactivehplc-ms/ms图谱；
图17显示本申请的灰星鲨混合型多肽的qexactivehplc-ms/ms图谱；
图18显示本申请的灰星鲨混合型多肽的qexactivehplc-ms/ms图谱；
图19显示本申请的灰星鲨混合型多肽的紫外吸收峰；
图20显示本申请的灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶的ic50为0.4mg/ml；
图21显示本申请的灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机理为不可逆抑制；
图22显示在30℃恒温条件下测定波长为475nm的光密度值随时间的增长曲线；
图23显示本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16黑色素瘤细胞殖率影响；横坐标为不同浓度的灰星鲨混合型多肽处理组(灰星鲨混合型多肽的浓度分别为0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml,不同浓度用ph7.2-7.4的0.01m磷酸盐缓冲液稀释)，纵坐标为细胞相对增殖率(24h)；
图24显示本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16黑色素瘤细胞殖率影响；横坐标为不同浓度的灰星鲨混合型多肽处理组(灰星鲨混合型多肽的浓度分别为0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml,不同浓度用ph7.2-7.4的0.01m磷酸盐缓冲液稀释)，纵坐标为细胞相对增殖率(48h)；
图25显示本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16黑色素瘤细胞内相对黑色素含量的影响；不同浓度的灰星鲨混合型多肽处理组(样品管从左到右分别表示灰星鲨混合型多肽的浓度分别为0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml的处理组)；
图26显示本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16黑色素瘤细胞内相对黑色素含量的影响；横坐标为不同浓度的灰星鲨混合型多肽处理组(灰星鲨混合型多肽的浓度分别为0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml)，纵坐标为相对黑色素含量；
图27显示本申请的灰星鲨混合型多肽的dpph自由基清除能力；其中，每条曲线代表的灰星鲨混合型多肽浓度分别为(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)；
图28显示本申请的灰星鲨混合型多肽的abts清除能力；其中，每条曲线代表的灰星鲨混合型多肽浓度分别为(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)；
图29显示本申请的灰星鲨混合型多肽的frap(还原效果)；其中，每条曲线代表的灰星鲨混合型多肽浓度分别为(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)；
图30显示小鼠灌胃前后的体重增长情况，结果显示小鼠灌胃前后的体重增值正常；
图31显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中对照组病理学心脏切片显微照片；
图32显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中灰星鲨混合型多肽组病理学心脏切片显微照片；
图33显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中对照组病理学肝脏切片显微照片；
图34显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中灰星鲨混合型多肽组病理学肝脏切片显微照片；
图35显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中对照组病理学脾脏切片显微照片；
图36显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中灰星鲨混合型多肽组病理学脾脏切片显微照片；
图37显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中对照组病理学肺脏切片显微照片；
图38显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中灰星鲨混合型多肽组病理学肺脏切片显微照片；
图39显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中对照组病理学肾脏切片显微照片；
图40显示灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验中灰星鲨混合型多肽组病理学肾脏切片显微照片；
图31至图40表明灰星鲨混合型多肽亚急性毒理实验，各脏器(心、肝、脾、肺、肾)病理学切片并没有病变现象；
图41显示灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中心脏的脏器系数；
图42显示灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中肝脏的脏器系数；
图43显示灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中脾脏的脏器系数；
图44显示灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中肺脏的脏器系数；
图45显示灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中肾脏的脏器系数；
图41至图45表明灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验中各脏器(心、肝、脾、肺、肾)脏器系数正常；
图46示出本发明的灰星鲨混合型多肽样品。
具体实施方式
灰星鲨混合型多肽提取的酶种类对比分析
在曲酸酸性蛋白酶、舒替兰碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰酶的最适条件下，进行灰星鲨混合型多肽的提取。以多肽dpph清除率和frap能力为纵坐标，酶种类为横坐标作图。结果如图1和图2显示，木瓜蛋白酶的酶解能力最好。
木瓜蛋白酶酶解灰星鲨鱼皮的单一条件研究
50g去除脂肪的灰星鲨鱼皮(湿重)加入15倍体积超滤水(750ml)，加热至沸腾，在超滤水沸水浴中浸烫处理40min，待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。分别加入5％(木瓜蛋白酶与灰星鲨鱼皮的质量比)的木瓜蛋白酶(酶活为3500μ/mg)，酶解温度55℃，酶解时间4h。酶解的ph值分别为4、5、6、7、8。以水解产物dpph自由基清除率和frap为指标。如图3和图4所示，说明对木瓜蛋白酶而言，ph值5.0时酶解灰星鲨鱼皮蛋白质的活性最高，酶解效果最好。
50g去除脂肪和杂蛋白的灰星鲨鱼皮(湿重)加入20倍体积超滤水(1l)，沸水浴浸烫处理30min。待其冷却室温，搅碎。等量分成5份。每份加入5％(木瓜蛋白酶与灰星鲨鱼皮的质量比)的木瓜蛋白酶(酶活为3500u/mg)，酶解的ph为5.0，酶解时间4h。酶解温度为50℃、55℃、60℃、65℃、70℃。以水解产物dpph自由基清除率和frap为指标评价酶解效果。如图5和图6所示，说明对木瓜蛋白酶而言，温度为50℃时酶解灰星鲨鱼皮蛋白质的活性最高，酶解效果最好。
50g去除脂肪和杂蛋白的灰星鲨鱼皮(湿重)加入25倍体积超滤水(1250ml)，沸水浴浸烫处理20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成6份。每份加入5％(木瓜蛋白酶与灰星鲨鱼皮的质量比)的木瓜蛋白酶(酶活为3500u/mg)，酶解的ph为5.0，酶解温度50℃。酶解时间为1h、2h、3h、4h、5h、6h。以水解产物dpph自由基清除率和frap为指标。结果如图7和图8所示，对木瓜蛋白酶而言，酶解3h时酶解灰星鲨鱼皮蛋白质的活性最高，酶解效果最好。
50g去除脂肪和杂蛋白的灰星鲨鱼皮(湿重)加入20倍体积超滤水(1l)，沸水浴浸烫处理20min。待其冷却室温，搅碎。等量分成6份。分别加入0.5％(木瓜蛋白酶与灰星鲨鱼皮的质量比)、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％木瓜蛋白酶，酶解的ph为5.0，50℃中酶解，酶解3h，以水解产物dpph自由基清除率和frap为指标。如图9和图10所示，说明对木瓜蛋白酶而言，酶量为5.0％时酶解灰星鲨鱼皮的蛋白质活性最高，酶解效果最好。
灰星鲨混合型多肽提取的复合条件优化
在木瓜白蛋白酶的单一条件优化的基础上，进行响应面实验。以多肽frap为衡量指标，最优的提取条件是ph为5.0±0.5、在50±0.5℃的温度下水解3.5±0.3h，所需酶量为4±0.5％，如图11至图13所示。
灰星鲨混合型多肽的平均分子量测定方法
利用高效液相色谱-质谱联用技术，以体积比为50％can(乙腈)为溶剂配制质量分数为0.1％的tfa(三氟乙酸)的溶液，取1ml超声重溶肽粉。吸取1μl重溶的灰星鲨鱼皮混合多肽溶液和1μlα-hcca(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质溶液混匀点于质谱仪样品靶上，待样品基质挥发结晶后，用基质辅助激光分析电离飞行时间质谱仪(maldi-tofms)进行上机分析。如图14至图18所示，灰星鲨鱼皮多肽的平均分子量小于1kda。
灰星鲨混合型多肽的微量元素分析方法
通过国标gb5009.241-2017方法，用火焰原子吸收光谱法测定镁元素含量。
通过国标gb5009.90-2016方法，用火焰原子吸收光谱法测定铁元素含量。
通过国标gb5009.91-2017方法，用火焰原子吸收光谱法测定钾、钠元素含量。
通过国标gb5009.92-2016方法，用火焰原子吸收光谱法测定钙元素含量
通过国标gb5009.93-2017方法，用氢化物原子荧光光谱法测定硒元素含量。
通过国标gb5009.13-2017方法，用火焰原子吸收光谱法测定铜元素含量。
通过国标gb5009.14-2017方法，用火焰原子吸收光谱法测定锌元素含量。
灰星鲨混合型多肽的金属元素分析方法
通过国标gb5009.17-2014方法，用氢化物原子荧光光谱法测定总汞元素含量。
通过国标gb5009.15-2014方法，用石墨炉原子吸收光谱法测定镉元素含量。
通过国标gb5009.12-2017方法，用石墨炉原子吸收光谱法测定铅元素含量。
通过国标gb5009.11-2014方法，用电感耦合等离子体质谱法测定总砷元素含量。
灰星鲨混合型多肽的氨基酸组分分析方法
通过国标gb5009.124-2016方法，用氨基酸分析仪测定样品中的氨基酸组分。
实施例1
灰星鲨混合型多肽的制备及其基本的理化性质
取适量新鲜或冻存解冻后的灰星鲨鱼皮，用超滤水冲洗干净，剪成1cm*1cm左右的小块，用10％乙醇(异丙醇、正丁醇)去除脂肪的时间为48h，温度为4℃，间隔12h换液一次；其中所述10％乙醇(异丙醇、正丁醇)的量与所述灰星鲨鱼皮重量(湿重)的比例为1l/(50±5)g。
去除脂肪和杂蛋白的灰星鲨鱼皮在超滤水中沸水浴中浸烫处理的时间是35±5分钟。所加超滤水的量与灰星鲨鱼皮重量(湿重)的比例为1l/(50±5)g。经沸水处理后，待其冷却室温，匀浆搅碎。调节ph5.0±0.5，按照加入4±0.5％木瓜蛋白酶，在50±0.5℃的温度下水解3.5±0.3h左右，期间不定时搅拌。沸水浴浸烫处理10分钟使酶灭活。降至室温，8000～12000rpm离心20min。取上清液用300目滤网过滤，冷冻干燥得到灰星鲨混合型多肽。样品如图46所示。
取样进行高效液相色谱-质谱(maldi-tofms)分析，分析结果见图14-18所示的maldi-tofms图谱。图14-18显示，由实施例1得到的灰星鲨混合型多肽的分子量小于1.0kda。分子量较小，说明在木瓜蛋白酶处理时酶解充分。
图19显示实施例1得到的灰星鲨混合型多肽的水溶液经紫外全波长扫描后在220nm左右有最大吸收峰，这是胶原蛋白的特征吸收峰。在280nm处有其他蛋白的吸收峰，符合混合型多肽的要求。
表1显示实施例1得到的灰星鲨混合型多肽的氨基酸组分、微量元素和金属元素分析。
表1
由表1可知，本申请的灰星鲨鱼皮混合多肽氨基酸含量相对于胶原蛋白氨基酸含量有了大幅度提高，微量元素种类丰富，含量高，重金属含量符合国家标准。
实施例2
本申请的灰星鲨混合型多肽的体外吸湿、保湿效果研究
材料在潮湿空气中吸收水分的性质称为吸湿性。根据保湿剂保湿性能的差异，不同浓度保湿剂对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同。
将实验所需的称量瓶至于55℃烘箱内烘干至横重，精确称量干燥的样品0.5g左右于称量瓶中，将称量瓶放置于放有饱和碳酸钠溶液(rh＝43％)的干燥器，分别称取48h后和96h后的质量，根据下面的计算公式计算吸湿率：
吸湿率(％)＝(w1-w0)/w0×100％
其中w0为样品的初始重量，w1为样品放置48h后和96h后的重量。
将干燥器中的饱和碳酸钠溶液取出，将上述吸湿后的样品继续放置48h，称取样品质量w2，由继续放置前后的样品质量差，根据下面的计算公式计算吸湿率：
吸湿率(％)＝(w2-w0)/w0×100％
其中w0为吸湿96h后样品重量，w2为将干燥器中的饱和碳酸钠溶液取出，将上述吸湿后的样品继续放置48h后的重量。
表2
表3
如表2和表3的结果显示，本申请的灰星鲨混合型多肽具有良好的吸湿保湿效果。
实施例3
本申请的灰星鲨混合型多肽的美白效果的研究
酪氨酸酶能诱导细胞产生黑色素，当紫外线(b波、a波)照射到皮肤上(b波即uvb作用于皮肤基底层，而a波更强，其作用于皮肤的真皮层)，肌肤就会处于“自我防护”的状态，通过紫外线刺激麦拉宁色素，激活酪氨酸酶的活性，保护皮肤细胞。酪氨酸酶与血液中的酪氨酸反应，生成一种叫“多巴”的物质。多巴其实就是黑色素的前身，经酪氨酸氧化而成，释放出黑色素。黑色素又经由细胞代谢的层层移动，移动到肌肤表皮层形成雀斑、晒斑、黑斑等形状。
1、灰星鲨混合型多肽对体外酪氨酸酶的半抑制率
测定灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶二酚酶的作用，研究其半抑制率。测定使用3ml体系。效应物溶于水，制成含不同浓度效应物的溶液。以0.5mmol/ll-dopa(左旋多巴)为底物，在0.05mol/l磷酸缓冲液(ph6.8)的3ml活性检测体系中，先加入0.1ml不同浓度的效应物于比色杯中，再加入2.8ml预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入0.1ml酪氨酸酶溶液，立刻混匀，在30℃恒温条件下测定波长为475nm的光密度值随时间的增长直线，从直线的斜率求得酶活力。以酶的相对剩余活力对效应物浓度作图，得到效应物的浓度效应曲线；根据酶相对剩余活力为50％时的数据，对应得到的效应物浓度，求得效应物的ic50值。图20显示了本申请的灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶的ic50为0.4mg/ml。
2、灰星鲨混合型多肽对体外酪氨酸酶的抑制类型
根据上述步骤得到的ic50值。改变加入的酶的量，测定不同浓度效应物对酪氨酸酶催化l-dopa(左旋多巴)氧化活力的影响。以酶经效应物作用后的剩余酶活力对加入的酶量作图，由此判断效应物对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机理。图21显示了本申请的灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶二酚酶的抑制作用机理为不可逆抑制。
3、灰星鲨混合型多肽对酪氨酸酶单酚酶活力分析
酪氨酸酶的单酚酶活力测定以l-tyrosine(l-酪氨酸)为底物，测定效应物对蘑菇酪氨酸酶单酚酶催化反应的动力学曲线影响。采用3ml体系，以2mmol/l(终浓度)tyr(酪氨酸酶单酚酶底物)为底物，在3ml0.05mol/l磷酸缓冲液(ph6.8)(终浓度)的测活体系中，先加入100μl含不同浓度的灰星鲨鱼皮多肽于比色杯中，再加入2.8ml0.05mol/l磷酸缓冲液，预先在30℃恒温水浴保温的底物溶液，然后加入酪氨酸酶100μl，立刻混匀，在30℃恒温条件下测定波长为475nm的光密度值随时间的增长曲线。结果如图22所示。如图所示，本申请的灰星鲨混合型多肽对单酚酶具有抑制作用。
4、灰星鲨混合型多肽对小鼠b16f10黑色素瘤细胞增殖的影响
图23显示了本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16f10黑色素瘤细胞内增殖的影响。采用rpmi-1640培养基(含有体积比为10％的新生小牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，在co2孵箱37℃，co2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25％(胰蛋白酶质量与水质量比)胰蛋白酶消化收集并调整细胞浓度，在96孔细胞培养板中，加入小鼠b16f10黑色素瘤细胞单细胞悬液，每孔200μl，过夜，待贴壁后，弃培养液。同时加入含灰星鲨鱼皮多肽不同浓度的培养液，继续培养24h-48h后每孔加入20μl的0.5mg/mlmtt(4，5-二甲基噻唑-2)(避光)，在co2孵箱37℃，co2＝5％的饱和湿度条件下培养细胞4h后，弃上清液，每孔加入180μldmso，在室温条件下，避光震荡10min左右，使甲替结晶完全溶解，立即用酶标仪测定570nm光吸收值。每一浓度设5个复孔，取平均值。每一次实验均取同一传代细胞。
横坐标为不同浓度的灰星鲨混合型多肽处理组(灰星鲨混合型多肽的浓度分别为0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml，不同浓度用ph7.2-7.4的0.01m磷酸盐缓冲液稀释)，纵坐标为细胞相对增殖率。图23和图24说明了在0～1280μg/ml范围内，灰星鲨混合型多肽对小鼠b16f10黑色素瘤细胞没有毒害作用。
5、灰星鲨混合型多肽对小鼠b16f10黑色素瘤细胞黑色素含量的影响
采用rpmi-1640培养基(含有10％新生小牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100μg/ml)，在co2孵箱37℃，co2＝5％的饱和湿度条件下复苏细胞。待细胞生长至近融合状态，经0.25％(胰蛋白酶质量与水质量比)胰蛋白酶消化，传代，并将培养基换成dmem。待细胞生长至近融合状态，胰酶消化收集并调整细胞浓度，于6孔板中培养，并继续用dmem培养24h，贴壁后，弃培养液。同时加入含灰星鲨混合型多肽不同浓度的dmem培养液，再继续培养3～4天。(注意：因为细胞培养时间较长，因此在调整细胞浓度时不宜太密集，细胞密度的调整是实验成功的关键)显微镜下可明显观察到细胞内黑色素的生成。用ph7.4的pbs缓冲液洗涤2次，胰酶消化。加培养液终止消化，离心，收集细胞。细胞沉淀用100μl(视情况加减)1mol/lnaoh(含体积比为10％的dmso)溶解，80℃孵育2h或100℃孵育30min。孵育过程要防止沉淀的产生，一旦产生沉淀会影响吸光值。冷却至常温后，转移至96孔板，405nm处测吸光值。
图25和图26显示了本申请的灰星鲨混合型多肽对小鼠b16f10黑色素瘤细胞黑色素含量的影响。在0(ctr)、80、160、320、640、1280μg/ml的浓度范围下，灰星鲨混合型多肽明显抑制了b16f10黑色素含量的生成。
实施例4
本申请的灰星鲨混合型多肽的抗氧化能力
1、灰星鲨混合型多肽对dpph自由基的清除能力
dpph法根据brand-williams等已建立的方法，取2ml不同浓度的灰星鲨鱼皮多肽(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)，加入2ml0.004％dpph甲醇溶液。混合均匀后，室温静置30min，在517nm处测定吸光值。空白样品采用无水乙醇。
抑制率(％)＝[(a0－a1)/a0]×100％
其中a0(加2ml无水乙醇和2mldpph乙醇溶液)为加入样品前的吸光值，a1为加入样品后的吸光值。
图27表明，灰星鲨混合型多肽对dpph有较好的清除能力，并且随质量浓度的增加而不断加强，当浓度为3mg/ml时，其对dpph的清除率可达100％，对dpph的半清除浓度为1mg/ml。
2、灰星鲨混合型多肽对abts自由基的清除能力
将0.1ml不同浓度的灰星鲨混合型多肽(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)，加入3.9mlabts工作液(od734nm为0.700±0.05)，混合均匀后，室温下静置6～10min，在734nm处测定吸光值。空白样采用80％乙醇。
抑制率(％)＝[(a1－a0)/a0]×100％
其中a0(加0.1ml80％乙醇和3.2mlabts工作液)为加入样品前的吸光值，a1为加入样品后的吸光值。
图28表明，灰星鲨混合型多肽对abts有较好的清除能力，并且随质量浓度的增加而不断加强。当浓度为3.5mg/ml时，其对abts的清除率可达90％，对abts的半清除浓度为1mg/ml。
3、灰星鲨混合型多肽对frap的影响
将0.1ml不同浓度的灰星鲨鱼皮多肽(0(ctr)、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/ml)，加入0.5mlpbs(ph6.6)和0.5ml铁氰化钾，50℃水浴20min。取出加入0.5ml三氯乙酸混匀，再加入0.5ml超滤水和0.5ml三氯化铁，室温静置10min，在700nm处测定吸光值。空白样采用超滤水。
还原力(％)＝[(a1－a0)/a0]*100％
其中a0(加0.1ml超滤水、0.5mlpbs(ph6.6)、0.5ml铁氰化钾、0.5ml三氯乙酸、0.5ml超滤水和0.5ml三氯化铁)为加入样品前的吸光值，a1为加入样品后的吸光值。
图29表示不同混合多肽浓度下的frap还原效果。结果表明，灰星鲨混合型多肽有较好的抗氧化活性。
实施例5
本申请的灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验
选取4周龄大的c57bl6小鼠，按重量随机分成实验组和对照组，每组12只，雌雄各6只。实验组通过灌胃给予灰星鲨混合型多肽，每次灌胃量1g/kg，间隔一天灌胃一次，累积灌胃时间4周，累积灌胃剂量15g/kg。对照组小鼠给予相同剂量超滤水灌胃。小鼠灌胃前后称重，计算小鼠体重变化(图30)。图30表明，给予小鼠灰星鲨混合型多肽前后，小鼠体重增长趋势平稳，并无显著降低。
小鼠在饲养期间毛色正常，饮食、活动和大小便正常，鼻、眼和口腔无异常分泌物，无异常现象。
随后小鼠通过1×pbs和2％pfa心脏灌流致死，取主要功能性脏器(心、肝、脾、肺、肾)。
各功能性脏器(心、肝、脾、肺、肾)无明显肿胀、畸形、坏死、萎缩等现象，脏器颜色光泽一致。
各功能性脏器(心、肝、脾、肺、肾)在2％pfa(ph7.2～7.4)固定6～8h，成长，计算脏器系数。
脏器脱水处理后，做he染色病理学切片，观察脏器是否病变。
图31至图40显示，各功能性脏器(心、肝、脾、肺、肾)病理学切片染色颜色清晰，组织结构完整，未见组织、细胞明显皱缩、病变和坏死。
图41至图45显示，各功能性脏器(心、肝、脾、肺、肾)脏器系数稳定，与对照组无明显差异性。
以上灰星鲨混合型多肽的亚急性毒理实验表明，灰星鲨混合型多肽并没有毒副作用。
综上所述，以上仅为本申请的较佳实施例而已，并非用于限定本申请的保护范围，因此，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。