本发明涉及微生物技术领域，具体涉及耐高温高酸型柠檬酸生产菌株的快速筛选方法。
背景技术：
柠檬酸化学名称2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸，被广泛应用于食品、医药和化工等行业，是世界上以生物化学方法生产量最大的有机酸。近年来，柠檬酸的需求量越来越大。目前，生产柠檬酸的主要方法有化学合成法和生物发酵法。化学合成法使用大量的化学试剂，并且合成步骤繁琐、原料较贵，难以应用于食品生产，生物发酵法工艺成熟、成本低廉、产量大，大量供应食品工业。目前市场上90％以上的柠檬酸都是通过生物发酵法生产的。
黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产柠檬酸、淀粉酶、酸性蛋白酶等多种产品，其中全球80％以上的柠檬酸是由黑曲霉发酵得到的。但是，当前柠檬酸生产用菌株多为不耐高温菌株，柠檬酸发酵过程是产热的过程，在这个过程中需要大量的循环冷却水以维持发酵温度。因此发酵生产过程中需要大量冷却水控制发酵温度。在国内，柠檬酸菌种一般选用黑曲霉(aspergillusniger)，该菌种的发酵温度目前是37.5℃左右。提高发酵温度可大幅减少循环冷却水，循环冷却水用量的减少降低了水耗和运转能耗，同时也节约了设备投资。提高柠檬酸菌种黑曲霉的耐热性，将发酵温度提高1-5℃，可节约大量的生产成本。而且，耐高温柠檬酸生产菌通常具有生长快、代谢活力高、发酵周期短的特点，有利于提高设备利用率，减少冷却水用量，降低生产成本。
黑曲霉作为传统的发酵工业菌种，对其进行菌种改良一直是研究热点。菌株的选育是发酵工业的关键技术，而国内的现有技术中对柠檬酸生产菌株的选育仍集中在提高菌株的产酸上。目前国内外对于高产型菌株的重点关注，对于耐高温菌株的研究应用较少。另外，由于发酵过程中产生柠檬酸以及其他杂质酸，导致发酵液ph下降，随着产酸量提高，严重影响了菌种的代谢和发酵。
因此，若能通过诱变育种的方法提高菌株的耐热耐酸性，并具有较高的产酸性，不仅可降低柠檬酸生成的耗能，还可提高柠檬酸产量，在柠檬酸工业中将具有较好的应用前景。
关于柠檬酸生产菌黑曲霉的筛选，国内外有很多报道，常规操作主要是采用物理和化学手段进行诱变育种。各种诱变剂有其作用的特殊性，在实际工作中一般都是根据结果验证来证明诱变效果较好的因素。目前对黑曲霉育种较为有效的诱变因子有：γ-射线、x-射线、紫外线、激光、亚硝基胍(ntg)、亚硝基脲、乙基胺等，此外还有高能电子流、电磁场等。利用这些诱变因子在黑曲霉育种工作中已取得了不少成果。例如上海工业微生物研究所从野生黑曲霉628作为出发菌株复合诱变获得了高产柠檬酸菌株co827，产酸达12～13％。无锡工业大学以黑曲霉h-142为出发菌株，通过γ射线、硫酸二乙脂、高温单独或复合诱变处理，通过高温、高酸及高渗培养条件的定向筛选获得hql-601菌种，它的发酵温度可达40℃。现有技术中的柠檬酸生产相关专利可举例如下。
cn107937325涉及一种柠檬酸杆菌菌株及其应用。该柠檬酸杆菌(citrobactersp.)名称为除臭菌zt-s5，于2017年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为cgmccno.15120。本发明提供的柠檬酸杆菌菌种活力高，适应性强，可广泛用于水体和气体中硫化氢和氨的生物处理过程中。以该菌株吸附后制成的生物除臭装置，能很好地抵御废气的冲击，实现生物除臭的应用
cn108018216公开了一种提高柠檬酸发酵中糖利用率和柠檬酸酸产量的方法及应用，该方法是通过敲除生产柠檬酸的黑曲霉中的葡萄糖基转移酶基因，构建基因工程菌，并将其用于柠檬酸发酵来实现。葡萄糖基转移酶基因的敲除可以使还原糖含量降低8.96-9.89％，总糖含量降低9.78-10.26％，异麦芽糖含量降低6.12-7.01％，柠檬酸产量提高10.28-12.16％。
cn103194398涉及了一株采用航天诱变手段获得的黑曲霉孢子，设计出高效的科学筛选方案从而实现诱变选育获得高产菌株，利用其发酵生产柠檬酸，平均产酸达到18％，发酵周期60小时，转化率99％。cn107815421公开了一种黑曲霉种子培养及其制备柠檬酸的方法，所述方法包括如下步骤：(1)取培养成熟的黑曲霉麸曲孢子，得到分散孢子悬液；(2)培养步骤(1)中的分散孢子悬液，得到发芽孢子；(3)发芽孢子重新分散，种子罐内培养，得到成熟种子液；(5)成熟种子液转至发酵罐内培养发酵，得到柠檬酸发酵液。本发明解决了孢子萌发过程中聚集的问题，提高孢子成球率，增加菌丝球数量，有效控制菌丝球的大小均一性，提高菌体的转化效率，发酵转化率提高，发酵周期缩短。
cn107815475a公开了一种通过两阶段发酵生产柠檬酸发酵液的方法，包括如下步骤：(1)取黑曲霉麸曲孢子，加入无菌水，制成孢子悬液，转接至种子罐内培养16～24h，得到种子液；(2)在发酵罐内加入占发酵罐有效体积8～12％的玉米液化液，将温度降至35～39℃；(3)将步骤(1)所得的种子液转至发酵罐内培养2～8h；(4)再在发酵罐内加入占有效体积60～64％的糖液继续培养，还原糖低于5g/l停止发酵，得到柠檬酸发酵液。本发明两阶段培养，避免了发酵前期ph下降和营养物质浓度对菌体生长的影响，提高淀粉质原料的利用效率和利用率，降低发酵残糖，提高糖酸转化率；增加产酸速率，缩短发酵周期。
虽然上述现有技术提供了诸多新的具有各种特性的柠檬酸生产菌株以及诱变方法，但是有公开高效率的菌株筛选方法，尤其是对于具有耐热耐酸性的高产型菌株研究较少，而且由于常规诱变手段的随机性和低效率性，现有技术不能提供更高效的筛选方法。
另外，黑曲霉经过多次物理诱变和化学诱变后，各项性能很难再提高。目前，用于工业化生产柠檬酸的黑曲霉菌种大都经过物理和化学诱变剂的处理，不同程度地增加了黑曲霉对一些诱变剂的抗性，使用同样的方法则很难对现有菌种进行改良。因此如何采用更为先进的技术手段实现对柠檬酸产生菌黑曲霉的诱变育种成为现在亟待解决的问题。
另一方面，获得诱变菌种后，菌株的筛选是菌种诱变后的步骤，也是决定选育效率的关键。微生物细胞群体经过诱变处理后，突变发生的频率仍很低，而且dna突变的发生是随机的。因此合理的筛选方法非常重要。诱变后需通过正确、灵敏、快速的筛选检测方法，从大量未变和负变的群体中把少量的正向突变挑选出来。
目前所有的育种方法中，原生质体融合起源于上世纪60年代，它是进行遗传育种研究的重要手段，也是获得菌种融合体和重组体的有效方法，灭活原生质体融合就是利用适当的方法处理单一亲株或双亲株的原生质体，其某一位置的生理结构产生微小损伤而失去再生能力，经融合后，由于致死损伤部位的互补而形成再生的融合体，因此，利用灭活原生质体融合技术选育耐高温生产菌株具有可行性。但是亲本菌株的诱变筛选较费时费力而且会带来一些不良突变。利用灭活原生质体作为供体进行融合是近年来选育的重要方向。原生质体电融合技术可以将两个或多个细胞的原生质体进行融合得到具有亲株遗传信息的新菌株。
对于灭活手段，主要为紫外线灭活。紫外线灭活主要与细胞内的核酸的光化学变化有关。其灭活的机制主要包括产生嘧啶二聚体以及dna解螺旋，由于紫外线照射致死损伤的部位主要在dna上，而在不同的原生质体中dna上致死损伤部位可能有所不同，所以灭活后可以互补而融合。
值得一提的是，离子注入是材料处理的通用技术，目前，运用离子注入进行品种改良已获得了成功，目前可大致将离子注入分为能量沉积、动量传递、粒子注入和电荷交换等四个反应过程。其作用机制较为复杂，很难用单一模式解释清楚。荷能离子注入除具有能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失，还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。从离子注入的致死率曲线等可以看出，这种诱变手段在机理上有别于传统方法。低能离子注入具有生理损伤小、突变率高等特点，能取得较高的正突变率。
另外，现有黑曲霉的诱变选育中，常以溴甲酚绿培养基上黄色指示圈的大小作为初筛依据，进行大规模淘汰，以提高筛选效率，但是并不能准确的反映菌株的产酸性能。因此，为获得耐高温高酸且产酸高、转化率高的柠檬酸菌种，寻求一种高效率而且快速的高通量筛选方法，具有重要的经济价值和生产价值。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术诱变手段的低效率和定向性差的缺陷，提供一种定向性好、高效率的柠檬酸生产菌的高通量快速筛选方法，所述柠檬酸生产菌为具有耐热耐酸性能的高产型黑曲霉菌株。
具体地，本发明的技术方案如下。
本发明的待筛选黑曲霉菌株，可以是分离自自然界的初筛产物，也可以是人工诱变菌株，优选人工诱变菌株。
本发明的柠檬酸生产菌的高通量快速筛选方法包括配制培养基、选择黑曲霉亲本菌株、制备黑曲霉融合菌株、融合菌株初步筛选、耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的筛选、摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试、以及任选的再次诱变选育等步骤。
具体地，所述方法包括如下具体步骤：
步骤(1)：配制培养基
配制菌种筛选和发酵所需的培养基，所述培养基包括：pda固体培养基、选择培养基、高酸型选择培养基、菌丝生长培养基(种子生长培养基)、平板高渗培养基以及基于玉米粉液化液与液化清液的摇瓶发酵培养基。
其中，所述的pda固体培养基组成(g/l)为：葡萄糖20，煮马铃薯200，琼脂20，mgso4·7h2o1.0，k2hpo42.0，硫酸铵0.5；无菌去离子水配制成1l后在0.1mpa、121℃下灭菌20min，倒入平板，冷却。
其中，所述的选择培养基为：pda固体培养基补加0.04％溴甲酚绿。
其中，所述的高酸型选择培养基：选择培养基的基础上添加80g柠檬酸。
其中，所述的菌丝生长培养基：不含琼脂的pda液态培养基基础上，补加酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l。
其中，所述的平板高渗培养基：pda固体培养基补加0.6mol/lnacl。
其中，所述的摇瓶发酵培养基通过如下制备步骤制备得到：取100克玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温α-淀粉酶(按每克玉米粉计12-15酶活力单位)，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续1-2h,当溶液呈基本透明状态碘液检验合格后，得玉米粉液化液，用滤布趁热挤压过滤得到玉米粉液化清液；将上述玉米粉液化液与液化清液按体积比1:4混合至1000ml，加入葡萄糖使其总糖浓度15-16wt％，加入mgso4·7h2o1克，k2hpo42克，硫酸铵2克，硫酸亚铁0.2克，mnso40.2克，121℃灭菌15min，即得摇瓶发酵培养基，备用。
步骤(2)：选择黑曲霉亲本菌株
选择亲本黑曲霉菌株，所述亲本菌株选择自耐高温菌株、耐高酸菌株、高产型菌株中的至少两种，优选选自耐高温黑曲霉菌株、耐高酸黑曲霉菌株，进一步优选至少其中一个菌株为柠檬酸高产型菌株，例如，耐高温型柠檬酸高产菌株，或耐高酸型柠檬酸高产菌株。
本发明中，具体地，所述诱变菌株例如可以选自：包括但不限于，高产性黑曲霉菌株co827；耐高温黑曲霉菌株aspergillusnigerzjs-8，其保藏编号为cctccno:m2011359，保藏单位中国典型培养物保藏中心；耐酸耐糖性黑曲霉诱变菌株cgmccno.5751，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；耐高温菌株黑曲霉诱变株，编号y711，保藏于工业生物技术教育部重点实验室，以及其他诱变菌株等等。
步骤(3)：制备黑曲霉融合菌株
黑曲霉融合菌株的制备包括原生质体的制备及灭活、原生质体融合步骤，具体步骤为：
1.黑曲霉原生质体的制备及灭活
s1：制备原生质体：在pda斜面上培养并选择生长良好的两亲本菌株孢子制成孢子悬浮液，稀释，取微量接种于菌丝生长培养基中，于35℃条件下的恒温摇床上培养24h；然后离心，将菌丝与培养基分离，并用0.8mol/lnacl溶液作为渗稳剂洗涤菌丝，置于离心管中，加入含有蜗牛酶、溶菌酶组分的复合酶液，恒温水浴振荡酶解2-3h，微滤膜过滤，离心，将滤液用渗稳剂洗涤，重悬，得到原生质体。
其中，所述复合酶液由蜗牛酶、溶菌酶和纤维素酶以质量比2：2:6的比例用pbs溶液配制，用0.22微米滤膜除菌；所述pbs缓冲液组分为：0.2mol/l磷酸缓冲液，0.4mol/l氯化铵，ph6.0。
s2：紫外灭活：将收集到的两亲株的原生质体分别稀释至105个/ml，置于培养皿中紫外照射一段时间进行紫外灭活。取适量悬浮液涂布高渗平板，观测并控制灭活率99％以上，优选100％(即灭活后在再生高渗平板上生长率为0)。
优选地，所述紫外灭活为15w紫外灯下15cm处振摇照射8-8.5min，灭活率基本可达100％。
其中，原生质体紫外灭活至少进行三组平行实验，每组包含两个亲本菌株的原生质体，从而得到至少三组灭活的双亲原生质体。
2.原生质体融合：
取两亲本菌株的灭活原生质体悬液分别用渗稳剂离心洗涤2-3次，然后以106个/ml的个数悬于电击液(0.6mol/l的甘露醇溶液)中。将每组两亲本菌株原生质体悬液等量混合摇匀，取少量注入融合仪电极小室进行电融合操作。
其中，电融合条件参数为：交变电场强度400v/cm，频率500khz，高压直流脉冲幅值1.80kv/cm，脉冲持续时间60微秒；脉冲间隔3-4s，脉冲个数5-6个。每组电融合操作至少重复三次，得到至少九组电融合液。
将融合后的各组电融合液用微量进样器接种在高渗平板上，在32-35℃下培养4-6天得到融合子菌株。其中，每组电融合液至少接种三个高渗平板，从而得到至少27组融合子高渗平板。
步骤(4)：融合菌株初步筛选
将每组高渗平板上生长的融合菌株点种到选择培养基平板上，每组高渗平板菌落至少点种三个选择培养基平板；将所有选择培养基平板在40-45℃下培养3-4天，从每个选择培养基平板中挑选至少一组变色圈较大的菌落，从而得到多株经耐高温初步筛选的融合黑曲霉菌株。
步骤(5)：耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的筛选
s1：耐高温高酸性能筛选
勾取上述经耐高温初步筛选的各融合菌配制成悬浮液，然后稀释并取适量均匀涂布于含溴甲酚绿的高酸型选择培养基上，40-44℃恒温培养箱中倒置培养2-3天，其中在高酸型选择培养基表面生长的菌落即为具有耐高温高酸性能的融合菌株。
s2：高产性能菌株的筛选
对于上述经耐高温高酸性能筛选后的批量菌株，采用快速高通量孔板筛选的方法进一步筛选高产型柠檬酸的菌株。
具体操作为，从上述高酸型选择培养基中挑取菌落形态大、变色圈大或者变色圈直径与菌落直径之比值较大(比值不低于3)的菌落，作为待筛选的批量菌株，转移到高通量深孔板的种子培养基(组分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，七水硫酸镁0.5g/l，无菌水配制)中，于35-37℃恒温振荡器中震荡培养24-36h，制得菌种液；将各菌种以10-20％的接种量转接到装有1ml发酵培养基的若干个96深孔板中，40-42℃发酵培养2-3天；取各深孔板发酵液0.5-0.8ml高速离心5-10min，取上清液经微滤膜过滤，所得滤液稀释，在高效液相色谱仪(hplc)中测定柠檬酸含量；选取产酸量高于至少一个亲本株的菌株进行发酵复筛实验。
其中，由于滴定法测定柠檬酸有较多干扰物，为避免杂酸等干扰测定结果，采用hplc测定柠檬酸含量。
具体地，hplc色谱及检测条件为：流动相:10mmol/lkh2po4溶液(ph＝3.8)；流速:1ml/min；进样量:10ul；温度:25℃；进样浓度:6-15mg/ml；紫外检测波长:210nm。
其中，进一步地，所述柠檬酸含量测定方法为：用移液器准确吸取离心后的发酵液0.5ml于1mlep管中，流动相溶液进行稀释并摇匀，再将溶液放入超声波装置中振荡3-5min,取出后用0.45微米微孔过滤膜进行过滤，作为待试品溶液。另外，精密称定纯柠檬酸标准品(无结晶水，含量为99.9％)201.7mg溶于10ml容量瓶中，同样用流动相溶液定容至刻度并摇匀，制成对照品溶液。以对照品峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度(mg/ml)为横坐标拟合线性关系，从而测定待试品溶液中具体柠檬酸含量。
步骤(6)：摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试
将上述步骤筛选出的多株耐高温高酸型柠檬酸高产菌株，接种到摇瓶内的50毫升玉米粉清液摇瓶发酵培养基内，40-42℃下每分钟200-300转振荡培养3-4天，然后用上述hplc法测定培养基中柠檬酸的产量，筛选得到在高温条件下产酸量不低于至少一个亲本株的融合菌株。
随后，将筛选出的融合菌株分别进行pda斜面传代8-10代，分别取2、3、5、7或8代斜面，再次进行摇瓶产酸测试，每组设三组平行实验，取平均值，保留40℃-42℃条件下的产酸水平稳定且产酸量较高的一株或多株菌株，从而得到耐高温高酸型柠檬酸高产菌株。
本发明中，进一步地，所述方法还包括诱变再筛选步骤。
具体地，所得到的耐高温高酸型菌株的柠檬酸产量与亲本菌株基本相当，或没有明显高于亲本菌株时，或者期望更加优良的性能时，可进行再次诱变选育，再次诱变选育操作如下。
步骤(7)：再次诱变选育：
按照本领域常规方法，以紫外照射、低能离子注入诱变、co-射线、γ-射线、亚硝基胍等一种或多种物理或化学诱变手段对所得菌株进行二次诱变或多次诱变，按上述耐高温高酸型高产突变菌株的筛选步骤进行筛选，其中摇瓶筛选条件为40-42℃高温发酵，保留产酸较高的菌株，并按上述步骤对其稳定性进行考察，直至得到耐高温高酸型柠檬酸高产黑曲霉菌株。
优选地，选择离子束注入诱变；有别于传统方法，低能离子注入具有生理损伤小、突变率高等特点，能取得较高的正突变率。
本发明中，所述离子束注入诱变的方法是：用15kev氮离子进行离子术注入操作，注入剂量为10～20×1015个n+/cm2，靶室真空度为1～5×10-3pa。
具体地，本发明所述离子束注入诱变操作为，将涂有孢子悬浮液的培养皿放入离子注入机内，靶室抽真空至1～5×10-3pa，选用15kev氮离子，10～20×1015/cm2剂量处理孢子，然后取出培养皿，以1ml无菌水洗脱，经稀释后涂布平板进行筛选。
本发明的有益效果:与现有技术相比，本发明的有益效果包括但不限于以下：
1.耐高温高酸柠檬酸生产菌具有耐酸性强、生长快、代谢活力高、发酵周期短的特点，有利于提高设备利用率，降低柠檬酸生成的耗能，减少冷却水用量，降低生产成本。
2.避免了常规诱变手段的随机性和低效率性，以及筛选定向性差的缺点，利用诱变菌株的融合手段消除了黑曲霉对一变剂的抗性，提高了筛选的定向性，从而得到具有亲株遗传信息的新菌株，而且克服了常规的亲本菌株的诱变筛选费时费力而且带来不良突变的缺陷。
3、本发明菌株筛选方法采用初筛、复筛和再次诱变相结合的快速筛选法，在大批量筛选的基础上具有高效率、高成功率的特点，其中选择培养基指示圈的大小作为初筛依据可进行大规模淘汰，而hplc测定法可以避免杂酸影响，提高高产菌株选取的准确性。
4.本发明菌株筛选方法包括在复筛的基础上通过离子注入等手段的再诱变步骤，其中离子注入的诱变手段在机理上有别于传统方法，具有生理损伤小、突变率高等特点，能取得较高的正突变率，可在筛选的优良菌株基础上进一步筛选更优良的品种，此外所述方法还适合各种性能菌株的进一步选育，适用性广。
具体实施方式
下面通过具体的制备例和实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
实施例1
配制培养基
配制菌种筛选和发酵所需的培养基，各培养基组成及配比如下：
pda固体培养基(g/l)组成为：葡萄糖20克，煮熟马铃薯200克，琼脂20克，mgso4·7h2o1克，k2hpo42克，硫酸铵0.5克；0.1mpa、121℃下灭菌20min，冷却。
溴甲酚绿选择培养基：pda固体培养基补加0.04％溴甲酚绿。
高酸型选择培养基：溴甲酚绿选择培养基的基础上添加80g柠檬酸。
菌丝生长培养基：不含琼脂的pda液态培养基基础上，补加酵母膏5g/l，蛋白胨5g/l。
平板高渗培养基：pda固体培养基补加0.6mol/lnacl。
摇瓶和发酵培养基通过如下制备步骤制备得到：
取100克玉米粉，加入300毫升水，搅拌均匀并加热到60℃，加入高温α-淀粉酶(按每克玉米粉计12酶活力单位)，升温至90℃，保持温度搅拌液化持续2h,当溶液呈基本透明状态碘液检验合格后，得玉米粉液化液，用滤布趁热挤压过滤得到玉米粉液化清液；将上述玉米粉液化液与液化清液按体积比1:4混合至1000ml，加入葡萄糖使其总糖浓度16wt％，加入mgso4·7h2o1克，k2hpo42克，硫酸铵2克，硫酸亚铁0.2克，mnso40.2克，121℃灭菌15min，即得摇瓶和发酵培养基，备用。
实施例2
制备黑曲霉融合菌株：
制备黑曲霉融合菌株包括选择黑曲霉亲本菌株并进行培养步骤和融合步骤，具体如下：
选择两亲本黑曲霉菌株为出发菌种，分别为耐高温和耐高酸诱变菌株，标记为黑曲霉a(aspergillusniger，保藏编号为cctccno:m2011359)和黑曲霉b(保藏号为cgmccno.5751)。在无菌操作条件下，将其稀释分离，涂布到平板培养基上，于36-37℃培养48h，用于制备融合菌株。
黑曲霉融合菌株的制备包括原生质体的制备及灭活、原生质体融合步骤，具体步骤为：
s1：制备原生质体：
将pda斜面上生长良好的两亲本菌株孢子制成稀释的孢子悬浮液，稀释至108个/ml，取100微升接种于菌丝生长培养基中，于35℃条件下的恒温摇床上以200r/min震荡培养24h；然后4000rpm离心5min，分离菌体，并用0.8mol/lnacl溶液作为渗稳剂洗涤菌丝，置于离心管中，按1mg/ml比例加入复合酶液(所述复合酶液由蜗牛酶、溶菌酶和纤维素酶以质量比2:2:6的比例用pbs溶液配制，用0.22微米滤膜除菌；所述pbs缓冲液组成为：0.2mol/l磷酸缓冲液，0.4mol/l氯化铵，ph6.0)，恒温水浴振荡酶解2h，微滤膜过滤，3000r/min离心15min，将滤液用上述nacl渗稳剂洗涤，重悬，得到原生质体。
s2：紫外灭活：
将收集到的两亲株的原生质体分别稀释至105个/ml，置于培养皿中紫外灭活，即15w紫外灯下15cm处振摇照射约8.5min，检测灭活率100％即停止紫外照射。
进行三组平行实验，从而得到三组灭活的双亲原生质体。
s3：原生质体融合：
取两亲本菌株的灭活原生质体悬液分别用nacl渗稳剂离心(3000r/min，10min)并洗涤2次，然后以106个/ml的个数悬于电击液(0.6mol/l的甘露醇溶液)中；将每组两亲本菌株原生质体悬液等量混合摇匀，注入电融合仪的电极小室进行电融合操作。电融合条件参数为：交变电场强度400v/cm，频率500khz，高压直流脉冲幅值1.80kv/cm，脉冲持续时间60微秒；脉冲间隔3s，脉冲个数5个。每组原生质体悬液电融合操作重复三次，得到九组电融合液。
将融合后的各组电融合液用微量进样器接种在高渗平板上，在32-35℃下培养4天得到融合子菌株。其中，每组电融合液接种三个高渗平板，从而得到27组融合子高渗平板。
实施例3
将每组高渗平板上融合后的菌株点种到选择培养基平板上，每组平板选择三处进行点种三个选择培养基平板，42℃下培养3天，从每个平板中挑选至少一组变色圈较大的菌落，共得到90株经耐高温初步筛选的融合黑曲霉菌株。
由于黑曲霉生长过程中产生的柠檬酸可改变菌落周围培养基的ph，使溴甲酚绿变色，出现黄色的变色圈，观测比较测量变色圈直径与菌落直径之比的大小，优先选取变色圈直径与菌落直径之比值较大的菌株，以备筛选。
实施例4
耐高温高酸型柠檬酸高产菌株的初步筛选
具体步骤如下：
s1：耐高温高酸性能筛选：划取上述经耐高温初步筛选的各融合菌，用100ml无菌水配制成悬浮液，然后10倍量稀释并取100μl均匀涂布于含溴甲酚绿的高酸型选择培养基上，42℃恒温培养箱中倒置培养3天，其中能够在高酸型选择培养基表面生长的菌落即为具有耐高温高酸性能的融合菌株，挑选生长良好的菌株，备筛。
具体地，从高酸型选择培养基中挑取菌落形态大、变色圈大或者变色圈直径与菌落直径之比值较大(比值不低于3)的菌落，作为待筛选的批量菌株，共得到68株菌株。
s2：高产性能菌株的筛选：对上述经耐高温高酸性能筛选后的68株菌株，采用快速高通量孔板筛选的方法进一步筛选高产型柠檬酸的菌株。其中，将筛选出的68株菌株转移到0.5ml的高通量深孔板的种子培养基(组分为：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，七水硫酸镁0.5g/l，无菌水灭菌配制)中，于37℃恒温振荡器中500r/min震荡培养24h，制得菌种液；将各菌种以15％的接种量转接到装有1ml发酵培养基的若干个96深孔板中，42℃发酵培养3天；取各深孔板发酵液0.5ml高速离心10min，取上清液经微滤膜过滤，所得滤液稀释，测定柠檬酸含量。
其中，采用hplc测定柠檬酸含量；选取产酸量高于至少一个亲本株的菌株进行发酵复筛实验。
其中，hplc色谱及检测条件为：
流动相:10mmol/lkh2po4溶液(ph＝3.8)；流速：1ml/min；进样量：10ul；温度：25℃；进样浓度：6-15mg/ml；紫外检测波长：210nm。
其中，柠檬酸含量测定方法：用移液器准确吸取离心后的发酵液0.5ml于1mlep管中，流动相溶液进行稀释并摇匀，再将溶液放入超声波装置中振荡3-5min，取出后用0.45微米微孔过滤膜进行过滤，作为待试品溶液。另外，精密称定纯柠檬酸标准品(无结晶水，含量为99.9％)201.7mg溶于10ml容量瓶中，同样用流动相溶液定容至刻度并摇匀，制成对照品溶液。以对照品峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度(mg/ml)为横坐标拟合线性关系，从而测定待试品溶液中具体柠檬酸含量。
经柠檬酸含量测定，共筛选得到37株(记为编号rh-01至rh-37)转化率在80％以上、产酸量高于至少一个亲本株的菌株；所得rh-01至rh-37的37株菌株柠檬酸产酸率均在10.0％以上，最高可达13.1％。
具体地，筛选后的37株菌株产酸量(g/100ml)范围分布在10.0-13.1，大多数菌株产酸量在10-11之间。
其中，产酸率在12％以上的菌株共9株，产率分别为：12.02、12.18、12.25、12.32、12.56、12.58、12.84、13.01、13.11。
实施例5
摇瓶发酵复筛与菌株遗传稳定性测试
将上述步骤筛选出的37株耐高温高酸型柠檬酸高产菌株，pda斜面培养后制成悬浮液，以40万/毫升的接种量接种到500ml三角摇瓶内的50毫升玉米粉清液摇瓶发酵培养基内，40℃以200rpm振荡培养3天，然后按照上述步骤测定培养基中柠檬酸的含量。
将在高温条件下产酸浓度不低于亲本株的融合菌株组分别进行pda斜面传代8代，分别取2、3、5、7、8代斜面，再次进行摇瓶发酵产酸测试，每组菌株设三组平行实验，取平均值，保留高温条件下产酸水平稳定且产酸量较高(高于12mg/ml)的菌株。
共得到耐高温高酸型柠檬酸高产菌株7株，记为编号gc-01至gc-07，所得菌株在40℃发酵周期72小时、传代8代后的柠檬酸平均产率(％)分别为：12.03、12.15、12.26、12.30、12.45、12.90、13.05。
实施例6
诱变再筛选
采用常规的离子束注入诱变法。
具体地，将编号gc-01至gc-07菌株进行pda斜面培养，配制孢子悬浮液，将涂有孢子悬浮液的培养皿放入离子注入机内，靶室抽真空至10-3pa，选用15kev氮离子，以10×1015/cm2的量处理孢子，进行离子注入诱变，诱变后取出培养皿，以1ml无菌水洗脱，经稀释后涂布平板按照实施例1-5的步骤进行耐高温高酸型高产突变菌株的筛选。
其中摇瓶筛选条件为40-41℃高温发酵，保留产酸较高的菌株，并对其传代稳定性进行考察，筛选得到传代稳定性高的柠檬酸产率在13％以上的耐高温高酸型柠檬酸高产黑曲霉菌株2株，记为编号zs-01，zs-02。
上述zs-01，zs-02菌株40℃下发酵周期72小时、传代8代后的柠檬酸产率分别为：13.43％、13.75％。
同时，分别测定其发酵周期60h的产酸量，结果表明，上述菌株40℃发酵周期60小时后的柠檬酸产率分别为：12.92％、13.15％，相对于低产亲本菌株的最高产酸率提高了接近30％；另外，相比较现有技术一般的菌株，具有明显缩短的发酵周期和耐高温高酸性能。
由此可以看出，相比较现有技术的随机诱变方法，本发明基于诱变株的融合-筛选-再诱变的复合高通量筛选方法快速高效，适合批量筛选，预期效果的定向性好，具备良好的生产价值。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。