本发明涉及一种微生物检测方法，尤其涉及一种食源性病原菌检测。
背景技术：
：食源性疾病是全球最普遍的公共卫生问题，其中，食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，因此，无论食品生产加工企业、食品卫生监管部门对食源性病原菌的常规监控或当食物中毒暴发时，快速识别食源性病原菌显得至关重要。常见食源性致病菌包括沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌等，是目前我国保证大宗食品安全的必检项目。食源性病原菌的传统检测方法是培养法，但操作繁琐，费时耗力，难以满足当今食品快速流通的检测需要，随着科学技术的发展和和进步以及人们食品安全意识的增强，对微生物快速检测技术的研究日渐深入，如基于遗传特征分析的实时荧光pcr、lamp、基因芯片等分子生物学方法、基于表型特征分析的全自动微生物鉴定仪、生物质谱等方法，这些方法不仅需要购置设备、配备专业技术人员，现代检测方法的检测限一般在102~104cfu/ml范围，由于食品经过加工、深加工、冷冻、包装、储藏等过程，食品中的致病菌会受到损伤，活力下降，为了防止带有致病菌食品的漏检，在检测前通常需要前增菌、甚至选择性增菌、选择性分离，获得纯菌落后才能上机实验，过程复杂繁琐，检测周期较长。应用细菌酶特异性分离和检测病原菌的原理已开发出多种产品，如利用吲哚类底物检测大肠菌群或金黄色葡萄球菌的培养基等，包括zl201310603799.9一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基、zl201410101820.x用于分离和检测阴沟肠杆菌的显色培养基、zl201110275619.x一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡等。这些培养基中添加了人工合成的糖苷类底物，该类底物的发色基团为不溶于水的吲哚类物质，其附着于菌落表面，被空气中的氧自然氧化产生颜色，通常观察固体平板上菌落生长的颜色变化来判断结果；也有使用产荧光的伞形酮类物质，可溶于水但培养基ph值变化影响其荧光强度，结果不稳定，且需要在365nm波长下观察荧光，目前仅限于大肠埃希氏菌的测定，还有酚类发色底物，在溶液中极易分解，只能现用现配，还有喹啉类发色基团等，需要借助其他物质发生化学反应才能产生颜色变化，总之，现阶段的产品均不适用于液体培养基，主要用于样品前增菌和选择性增菌之后对目标菌的分离，如食品安全国家标准gb4789.38-2012大肠埃希氏菌计数，伞形酮类物质仅用于增菌后对目标菌的分离计数。本发明所述的快速筛选食源性病原菌的方法主要应用试卤灵类底物。试卤灵属氧杂蒽类荧光染料，对其7-位酚羟基的取代作用会导致荧光淬灭、颜色变浅呈淡黄色，当取代基与相关物质作用而移除后，又重新释放出试卤灵，使溶液呈亮粉色并显示强的红色荧光，最大吸收波长为573nm左右，最大发射波长位于585nm处。当ph值从4至7时，荧光逐渐增强，当ph值＞7时，试卤灵主要以阴离子形式存在，而且光谱性质几乎不再随ph而改变。因为其分析波长长、受样品背景干扰少、水溶性好还具有良好的细胞膜通透性和分散性，目前主要应用于生物酶活性的测定，但尚未见用于病原菌的识别或检测。综上所述，目前对于食源性病原菌不能实现快速检测的技术瓶颈在于：如何缩短检测周期，即在增菌过程中即可获得检测结果；如何简化操作程序，将增菌、分离、鉴定合并成为一个步骤，免除细菌分离纯化及核酸提取、扩增等复杂操作程序；如何去除食品基质的干扰；如何降低成本，即无需购置设备和大量耗材。本发明所述的利用试卤灵类底物快速筛选食源性病原菌的方法可以很好的解决这些问题。技术实现要素：本发明的目的是克服现有食源性病原菌检测周期长、操作繁琐、成本高的不足，解决的技术问题是提供一种快速、便捷的食源性病原菌检测方法。本发明所采用的技术方案概述如下：一种快速筛查食源性病原菌的方法，所述食源性病原菌快速筛查方法基于细菌特异性酶反应，反应体系包括支持目标菌生长的营养成分、干扰菌抑制剂及细菌特异性酶反应底物，测试时将待检样品放入反应体系中，通过在适宜温度下培养5~8h，直接观察反应体系中的颜色变化或在573nm波长激发后，检测585nm处荧光的产生与否即可获得食源性病原菌定性检测结果。本发明的食源性病原菌快速筛查方法，无需前增菌和选择性增菌，一步直接培养即可获得检测结果，具有简便、快速、高效性的优点。本发明的有益效果是：本发明的快速筛查食源性病原菌方法，与常规检测方法相比，仅需一步操作，将前增菌、选择性增菌及目标菌识别同步完成。本发明食源性病原菌方法可荧光观察，不受样品基质干扰，提高了检测效率。本发明的快速筛查食源性病原菌方法适用于食品生产加工企业、食品卫生监控基层单位对食源性病原菌快速筛查和监测，应用前景广泛。附图说明图1是大肠埃希氏菌(iqcc10126)在试卤灵显色培养液中的可见光生长曲线图。具体实施方式下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1：本发明所述快速筛查食源性病原菌的方法对大肠埃希氏菌灵敏度的检测1)测试用菌株大肠埃希氏菌iqcc10126（等效于atcc25922），来自中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心。2)仪器设备恒温培养箱、高压灭菌锅、微量移液器(20~200μl、100~1000μl)、麦氏比浊管、比浊仪、bioscreen全自动生长曲线分析仪、荧光分光光度计等。3)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含多价蛋白胨20g、氯化钠5g、三号胆盐1.5g、月桂基硫酸钠0.1g，余量为水，调节ph为7.4±0.1制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入新生霉素0.0025g、头孢菌素0.015g、iptg0.03g，备用；称取0.005g试卤灵-β-d-葡萄糖醛酸甲脂溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；每升培养液加入1ml显色剂。4)菌液制备肉汤培养后，将大肠埃希氏菌接种在tsa平板，36℃培养，挑取菌落，用生理盐水制成均匀混悬液，配制成0.5麦氏浊度，此时菌液浓度约为108cfu/ml，依次梯度稀释成107-10cfu/ml菌液，备用。5)可见光强度测定使用自动微生物生长测定仪bioscreenc，每个梯度取30μl菌液，加入270μl专用大肠埃希氏菌培养液中。参数测定时间：24h，每15min测定一次，测定波长：420nm，培养温度36℃。6)荧光强度测定使用日本岛津荧光分光光度计rf-6000，每个梯度菌液培养8h后，加入适量naoh溶液，调节体系ph值为7.5，测量激发波长573nm下，585nm处荧光强度信号。7)结果分析根据生长曲线（见附图：其中图1是大肠埃希氏菌(iqcc10126)在试卤灵显色培养液中的可见光生长曲线图），样品1至样品7为梯度稀释的大肠埃希氏菌菌悬液，浓度依次为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml和10cfu/ml，对照为无菌生理盐水。当od值≥0.05时，菌液明显变成亮粉色。根据曲线监测，不同浓度的大肠埃希氏菌菌悬液显色的时间分别为1h,2.5h,3.5h,5.5h,6.5h,7.5h和8.5h，与实际显色时间完全一致。因此可根据体系的变色时间推算出样品中大肠埃希氏菌的数量级，实现半定量。多次实验发现，试卤灵底物在阴性条件下的荧光值＜8000。因此测量的不同浓度菌液，在培养8h后，测量激发波长573nm下，585nm处荧光强度信号，信号大于8000时证明产生了荧光，即为可检出的致病菌的最低检测浓度。根据实验数据，在8h内，使用试卤灵-β-d-葡萄糖醛酸甲脂做为底物检测大肠埃希氏菌的最低浓度为10cfu/ml。实施例2：本发明所述快速筛查食源性病原菌的方法对单核细胞增生李斯特氏菌的特异性检测1)测试用菌株单核细胞增生李斯特氏菌iqcc22225（等效于atccbaa-751）、单核细胞增生李斯特氏菌iqcc22226（等效于atcc15313）、单核细胞增生李斯特氏菌iqcc22264（等效于atcc19118）、大肠埃希氏菌iqcc10126、金黄色葡萄球菌iqcc22035（等效于atcc25923），来自中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心。2)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含细菌胰䏡蛋白胨15g、酪蛋白胨5g，酵母粉3g，丙酮酸钠2g、葡萄糖2g、磷酸甘油镁0.5g、硫酸镁0.5g、氯化钠5g、氯化锂5g、磷酸氢二钠2.5g，余量为水，调节ph为7.2±0.2制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入萘啶酮酸钠0.01g、头孢他啶0.005g、多粘菌素b0.01g、放线菌酮0.05g，备用；称取0.005g试卤灵-β-d-葡萄糖苷溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；每升培养液加入1ml显色剂。3)菌液制备肉汤培养后，将上述菌接种在tsa平板，36℃培养，分别挑取菌落，用生理盐水制成均匀混悬液，配制成0.5麦氏浊度，此时菌液浓度约为108cfu/ml，梯度稀释成105cfu/ml菌液，备用。4)特异性检测分别吸取1ml菌液，加入至分装的9ml单增李斯特菌培养液内36℃培养，观察反应体系中的颜色变化。5)结果分析实验结果证明，使用该方法可以有效筛选出单核细胞增生李斯特氏菌，而大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌不能在此培养液中生长。实施例3：本发明所述快速筛查食源性病原菌的方法对大肠菌群的检测1)测试用菌株布氏柠檬酸杆菌iqcc10229（等效于atcc43162）、产酸克雷伯氏菌iqcc10301（等效于atcc43165）、阴沟肠杆菌iqcc10401（等效于atcc13047）、大肠埃希氏菌iqcc10126、金黄色葡萄球菌iqcc22035，来自中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心。2)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含多价蛋白胨20g、氯化钠5g、三号胆盐1.5g、月桂基硫酸钠0.1g，余量为水，调节ph为7.4±0.1制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入新生霉素0.0025g、头孢菌素0.015g、iptg0.03g，备用；称取0.005g试卤灵-β-d-半乳糖苷溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；每升培养液加入1ml显色剂。3)菌液制备肉汤培养后，将上述菌接种在tsa平板，36℃培养，分别挑取菌落，用生理盐水制成均匀混悬液，配制成0.5麦氏浊度，此时菌液浓度约为108cfu/ml，梯度稀释成105cfu/ml菌液，备用。4)特异性检测分别吸取1ml菌液，加入至分装的9ml大肠菌群培养液内36℃培养，观察反应体系中的颜色变化。5)结果分析菌株布氏柠檬酸杆菌iqcc10229产酸克雷伯氏菌iqcc10301阴沟肠杆菌iqcc10401大肠埃希氏菌iqcc10126金黄色葡萄球菌iqcc22035结果++++-时间3.5h3h3h3h-实验结果证明，大肠菌群包含的几个菌属，埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属以及克雷伯氏菌属与阴沟肠杆菌，可以使培养液变色，使用该方法可以有效筛选出大肠菌群，而金黄色葡萄球菌不能在此培养液中生长。实施例4：本发明所述快速筛查食源性病原菌的方法对沙门氏菌的检测1)测试用菌株肠炎沙门氏菌iqcc10588（等效于atcc13076）、甲型副伤寒沙门氏菌iqcc10518（等效于cmcc50433）、鼠伤寒沙门氏菌iqcc30506（等效于atcc14028）、大肠埃希氏菌iqcc10126、金黄色葡萄球菌iqcc22035，均来自中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心。2)仪器设备恒温培养箱、高压灭菌锅、微量移液器(20~200μl、100~1000μl)、麦氏比浊管、比浊仪等。3)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含细菌胰䏡蛋白胨6g、大豆蛋白胨3g，酵母粉1g，牛胆盐3g、脱氧胆酸钠2g、柠檬酸钠8g、l-抗坏血酸钠2g，余量为水，调节ph为7.2，制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入阿拉磷0.001g、新生霉素0.005g、头孢磺啶0.012g，备用；称取0.005g试卤灵辛酸脂溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；4)菌液制备肉汤培养活化后，分别将上述菌接种在tsa平板，36℃培养，挑取菌落，用生理盐水制成均匀混悬液，配制成0.5麦氏浊度，此时菌液浓度约为108cfu/ml，梯度稀释成104cfu/ml菌液，备用。5)特异性检测分别吸取1ml菌液，加入至分装的9ml沙门培养液内36℃培养5~8h左右，调节ph值至7.5左右，滴加10μl沙门显色剂，混匀观察，观察反应体系中的颜色变化。6)结果分析菌株肠炎沙门氏菌iqcc10588甲型副伤寒沙门氏菌iqcc10518鼠伤寒沙门氏菌iqcc30506大肠埃希氏菌iqcc10126金黄色葡萄球菌iqcc22035结果+++--肠炎沙门氏菌iqcc10588，甲型副伤寒沙门氏菌iqcc10518和鼠伤寒沙门氏菌iqcc30506这三管沙门氏菌，在加入沙门显色剂后，体系在2min左右变成亮粉色；大肠埃希氏菌iqcc10126虽然也变成了亮粉色，但是变色时间在10min左右，远大于规定的5min以内；金黄色葡萄球菌iqcc22035则无明显变化。证明本发明所述的试卤灵快速筛查沙门氏菌的方法可以有效快速筛选出沙门氏菌。实施例5：本发明所述快速筛查食源性病原菌的方法对低浓度致病菌的检测1)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含多价蛋白胨20g、氯化钠5g、三号胆盐1.5g、月桂基硫酸钠0.1g，余量为水，调节ph为7.4±0.1制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入新生霉素0.0025g、头孢菌素0.015g、iptg0.03g，备用；称取0.005g试卤灵-β-d-半乳糖苷溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；每升培养液加入1ml显色剂。2)样品前处理无菌操作称取1g市售生猪肉，置于分装的9ml大肠菌群培养液内，36℃温度下培养，每个样品做3遍，这样取样相当于将样品中大肠菌群稀释了10倍。配套制备阴性对照组（无菌水）和阳性对照组（105cfu/ml大肠埃希氏菌iqcc10126）。可采用离心浓缩法，将样品中的大肠菌群进行浓缩后再进行检测。如无菌称取25g样品后，放入225ml生理盐水中均质拍打混匀。吸取100ml上清液，5000rpm离心15min后，去上清，加入1ml培养液吹吸混匀后培养。这样就将样品中大肠菌群的浓度浓缩了10倍左右。其中稀释10倍取样编号标为1,2,3；浓缩10倍取样编号标为4,5,6。3)结果分析样品阴性对照阳性对照123456变色时间（h）－398.58.566.57对照不同浓度的标准菌株的变色时间，得出样品中大肠菌群的浓度约为102cfu/g。证明体系的变色时间在一定范围内与样品中大肠菌群的浓度成正比。浓缩样品中目标菌浓度可以减少检测所需时间。实施例6：本发明所述快速筛查大肠菌群的方法与国家标准方法之间对比应用1)试剂制备按照配方每1000ml的培养液中包含多价蛋白胨20g、氯化钠5g、三号胆盐1.5g、月桂基硫酸钠0.1g，余量为水，调节ph为7.4±0.1制备培养液，121℃高压灭菌15min后，待冷却至45~55℃，加入新生霉素0.0025g、头孢菌素0.015g、iptg0.03g，备用；称取0.005g试卤灵-β-d-半乳糖苷溶解到1ml二甲基亚砜或正庚烷中制成显色剂，以过滤法除菌，备用；每升培养液加入1ml显色剂。按照gb4789.3中方法准备相应试剂与培养基。2)样品前处理选择市售生猪肉为样品基质，高压灭菌后人工添加高、中、低三个污染浓度（107cfu/g、104cfu/g、102cfu/g）的大肠埃希氏菌iqcc10126。国标方法按照gb4789.3的方法进行操作；本发明所述的试卤灵快速筛查方法：分别吸取1ml样品置于分装的9ml大肠菌群培养液内，36℃温度下培养，每个样品做3遍，记录样品明显变色的时间。3)结果分析高浓度中浓度低浓度gb4789.3(检测所需时间)＋（72h）＋（72h）－（72h）试卤灵快速筛查方法(检测所需时间)＋（1h）＋（5h）－（8h）根据国家冷鲜肉的微生物标准，要求冷鲜肉中大肠菌群的含量＜104mpn/100g，因此大于此浓度为阳性不合格样品，小于此浓度为阴性合格样品。本发明所述的试卤灵快速筛查方法，是根据体系的变色时间，推算样品中大肠菌群的浓度数量级。高中低三个污染浓度的变色时间分别为1h，5h和8h左右，对应的浓度的数量级分别为107cfu/g，104cfu/g和102cfu/g，与人工添加的大肠埃希氏菌的浓度相符。虽然在精确度上不如国标（8.4×106cfu/g，1.1×104cfu/g和85cfu/g），但是检测时间上远远小于国标所需的检测时间（国标检测为3天）。因此使用本发明所述的试卤灵快速筛查方法可以大大减少检测时间。虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。当前第1页12