本发明涉及生物技术领域中，检测kiaa0125基因表达水平的物质在辅助鉴定急性淋巴细胞白血病中的应用。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(acutelymphocyticleukemia,all)是起源于淋巴系统的一种恶性血液肿瘤。主要临床表现为淋巴细胞计数增多、贫血、皮肤和牙龈出血、肝脾肿大以及中枢神经系统浸润。目前尽管新型药物治疗及造血干细胞移植等明显改善了其预后，但仍有部分儿童和成人all患者，复发和死亡的结局不可避免。all临床异质性极高，异常的基因标记是不同疾病亚型分类的基础。但约10-30％的儿童all和30-50％的成人all缺少与诊断、微小残留病检测、预后评估等相关的分子标记物。
kiaa0125基因(ncbi编号：ng_001019.6)属于长非编码rna(lncrna)基因，定位于染色体14q32.33。该基因于1995年首次报道，但对于该基因在人类生理及病理状态下的机制的探索较少。目前研究主要集中于神经系统和生长发育方面。有研究表明，kiaa0125基因的表达水平在多发性硬化患者中显著下调，而在阿尔茨海默症中，该基因与另外一个与神经系统相关的基因neurog2起相互拮抗作用。通过构建细胞系模拟典型阿尔茨海默症状时，neurog2基因表达显著上调，而kiaa0125基因下调。一项对19例特发性矮小症患者基因组拷贝数分析发现18例患者在染色体区段14q32.33存在拷贝数扩增，认为该区段上的kiaa0125基因可能与调控身高的基因的表达相关。目前，尚未见kiaa0125基因与血液系统恶性肿瘤的相关报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是如何辅助鉴定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测kiaa0125基因表达水平的物质的下述任一应用：
x1)在制备鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病产品中的应用；
x2)在鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病中的应用；
x3)在制备鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有肿瘤产品中的应用；
x4)在鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有肿瘤中的应用；
x5)在制备鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞产品中的应用；
x6)在鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞中的应用；
x7)在制备预测或辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险产品中的应用；
x8)在预测或辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险中的应用；
x9)在制备预测或辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果产品中的应用；
x10)在预测或辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果中的应用。
上述应用中，所述检测kiaa0125基因表达水平的物质可包括检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂，所述检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂由引物对甲和探针甲组成，所述引物对甲由序列表中序列1和2所示的两条单链dna组成，所述探针甲的序列为序列表中序列3。
所述探针甲的两端还分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为fam。所述荧光淬灭基团具体可为bhq1。
所述检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂中，所述引物对甲的两条单链dna和所述探针甲的摩尔比可为40:40:25。所述引物对甲的两条单链dna和所述探针甲可独立包装。
上述应用中，所述kiaa0125基因表达水平可为kiaa0125基因相对于参照基因的相对表达水平。
所述检测kiaa0125基因表达水平的物质还可包括检测所述参照基因表达水平的试剂。
所述参照基因具体可为abl1基因。所述检测所述参照基因表达水平的试剂可由引物对乙和探针乙组成，所述引物对乙由序列表中序列4和5所示的两条单链dna组成，所述探针乙的序列为序列表中序列6。所述探针乙的两端还可分别标记有荧光基团和荧光淬灭基团。所述荧光基团具体可为fam。所述荧光淬灭基团具体可为tamara。
所述检测所述参照基因表达水平的试剂中，所述引物对乙的两条单链dna和所述探针乙的摩尔比可为40:40:25。所述引物对乙的两条单链dna和所述探针乙可独立包装。
所述检测kiaa0125基因表达水平的物质可仅由所述检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂组成，还可由所述检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂与所述检测所述参照基因表达水平的试剂组成。
本发明还保护以kiaa0125基因表达水平作为标志物的鉴定或辅助鉴定急性淋巴细胞白血病的物质在制备鉴定或辅助鉴定急性淋巴细胞白血病产品中的应用。
本发明还保护以kiaa0125基因表达水平作为标志物的鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为淋巴肿瘤细胞或血液肿瘤细胞的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为淋巴肿瘤细胞或血液肿瘤细胞产品中的应用。
本发明还保护以kiaa0125基因表达水平作为标志物的预测或辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险的物质在预测或预测待测对象患急性淋巴细胞白血病风险产品中的应用。
本发明还保护以kiaa0125基因表达水平作为标志物的预测或辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果的物质在预测或辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果产品中的应用。
本发明还保护所述检测kiaa0125基因表达水平的物质。
所述检测kiaa0125基因表达水平的物质可为试剂盒。
所述检测kiaa0125基因表达水平的物质的功能为如下y1)-y5)中任一种：
y1)鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有肿瘤；
y2)鉴定或辅助鉴定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病；
y3)鉴定或辅助鉴定待测细胞是否为肿瘤细胞；
y4)预测或辅助预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险；
y5)预测或辅助预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果。
本发明中，所述肿瘤可为液体肿瘤。所述肿瘤具体可为急性淋巴细胞白血病。所述肿瘤细胞可为液体肿瘤细胞。所述肿瘤细胞具体可为b系急性淋巴细胞白血病细胞系，如bv-173、sup-b15、ball-1。
本发明中，确定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病的方法如下：以abl1基因为内参，如所述待测对象的kiaa0125基因相对于abl1基因的相对表达水平≤23.6％，所述待测对象患有或候选患有急性淋巴细胞白血病；如所述待测对象的kiaa0125基因相对于abl1基因的相对表达水平>23.6％，所述待测对象不患有或候选不患有急性淋巴细胞白血病。
预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险的方法如下：待测对象kiaa0125基因的相对表达水平越低，患急性淋巴细胞白血病的风险越高；待测对象kiaa0125基因的相对表达水平越高，患急性淋巴细胞白血病的风险越低。
预测待测急性淋巴细胞白血病患者的治疗效果的方法如下：待测患者kiaa0125基因的相对表达水平越低，治疗效果越差；待测患者kiaa0125基因的相对表达水平越高，治疗效果越好。
本发明中，急性淋巴细胞白血病是指成人b系急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,all)。
治疗效果具体可通过骨髓象中原始与幼稚淋巴细胞的数目来确定。当骨髓象中原始与幼稚淋巴细胞的数目≤5％为血液学缓解状态。
实验证明，kiaa0125基因的表达水平与急性淋巴细胞白血病相关，患有急性淋巴细胞白血病的患者的kiaa0125基因的表达水平显著低于健康人。kiaa0125基因的表达水平还与急性淋巴细胞白血病患者的治疗效果有关，健康人kiaa0125基因的表达水平显著高于急性淋巴细胞白血病初诊患者和急性淋巴细胞白血病缓解患者，而急性淋巴细胞白血病缓解患者kiaa0125基因的表达水平显著高于急性淋巴细胞白血病初诊患者。表明kiaa0125基因的表达水平可以用于预测急性淋巴细胞白血病患者的发生和治疗效果。
附图说明
图1为rq-pcr检测阳性对照细胞系kiaa0125基因的荧光标准曲线。
图2为初诊组、缓解组以及正常组的kiaa0125基因的相对表达水平。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna的3′末端核苷酸。
实施例1、检测kiaa0125基因表达水平的成套试剂及灵敏度检测
一、成套试剂的组装
本实施例提供了一种针对kiaa0125基因(ncbi基因库序列号：nr_026800.2，序列表中序列7)的成套试剂，该成套试剂可用于检测kiaa0125基因表达水平，该成套试剂由引物对甲(由上游引物kiaa0125-fp和下游引物kiaa0125-rp组成，扩增产物为119bp)和探针甲(探针kiaa0125-probe)组成：
上游引物kiaa0125-fp:5’-gggaggtcaagagttggagca-3’(序列1)；
下游引物kiaa0125-rp:5’-catcccttcccaatgtccgt-3’(序列2)；
探针甲kiaa0125-probe:5’-fam-tcagttctgacagggcctcagacctaagg-bhq1-3’(序列3)。
本实施例的成套试剂中，上游引物kiaa0125-fp和下游引物kiaa0125-rp以及探针甲均独立包装，三者间的摩尔比为40:40:25。
二、步骤一的成套试剂的灵敏度
阳性对照细胞系：kg-1细胞系。
分别检测该细胞系梯度浓度稀释的cdna的kiaa0125基因的表达水平，每个浓度重复2次，并做标准曲线。步骤如下：
1、用trizol试剂盒(美国invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取kg-1细胞系的总rna，反转录为cdna。
2、将上述所得的cdna用灭菌双蒸注射用水进行10倍梯度稀释得到各个稀释液(以原浓度每微升cdna拷贝数为106，稀释液分别含有105、104、103、102、101、100个拷贝的cdna)。
将各个稀释液采用实施例1中步骤一的成套试剂在荧光实时定量pcr仪(美国abi公司7500-fast型)上进行rq-pcr。分析每批rq-pcr结果时阈值均固定为0.082。
pcr反应体系(10μl)均为：上游引物0.4μm，下游引物0.4μm，探针甲0.25μm，2×taqman通用pcr公共体系5μl(abi公司,美国)，模板cdna(即稀释液)1μl；其余为去离子水。
pcr反应条件均为：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，60℃1min，40个循环。
梯度稀释rq-pcr荧光标准曲线见图1(阈值为0.082)，函数为log10kiaa0125cdna拷贝数＝(ct-39.109)/-3.324,相关系数为0.999。上述实验结果显示，步骤一的成套试剂检测kiaa0125基因表达水平灵敏度可达10个拷贝。
实施例2、检测白血病患者及细胞系
一、试剂盒的组装
试剂盒由如下组件组成：实施例1的成套试剂以及针对作为内参基因的abl1基因(ncbi基因库序列号：nm_005157.5，序列表中序列8)的引物对乙和探针乙，引物对乙由上游引物abl1-f和下游引物abl1-r组成：
上游引物abl1-f(序列表的序列4)：5’-tggagataacactctaagcataactaaaggt-3’；
下游引物abl1-r(序列表的序列5)：5’-gatgtagttgcttgggaccca-3’；
探针乙abl1-t-probe(5’→3’):
fam-ccatttttggtttgggcttcacaccatt–tamra(核苷酸序列为序列表的序列6)。
二、应用步骤一的试剂盒检测细胞系
待测样本：两名健康志愿者的单个核细胞(单个核细胞1和2)，广州吉妮欧生物科技有限公司的bv-173、ball-1及atcc的sup-b15(
分别检测各个细胞系中的kiaa0125基因的表达水平。每个细胞系样本皆重复检测4次。步骤如下：
1、用trizol试剂盒(美国invitrogen公司)并参照试剂盒说明书在无菌条件下提取各个细胞的总rna,反转录为cdna。
2、以细胞的cdna为模板，用引物对甲和探针甲在荧光实时定量pcr仪(美国abi公司7500-fast型)上进行rq-pcr；以细胞的cdna为模板，用引物对乙和探针乙在荧光实时定量pcr仪(美国abi公司7500-fast型)上进行rq-pcr。分析每批rq-pcr结果时阈值均固定为0.082。
pcr反应体系和pcr反应条件同实施例1步骤二。
以kiaa0125基因的表达水平与abl1基因的表达水平的比值表示kiaa0125基因的相对表达水平(％)。结果见表1所示，kiaa0125基因在健康人单个核细胞1及单个核细胞2中的相对表达水平为47.1％、72.8％，在bv-173、sup-b15及ball-1中均无表达。
表1、血液肿瘤细胞系中kiaa0125基因的表达水平
三、应用步骤一的试剂盒检测急性淋巴细胞白血病患者
分别对若干急性淋巴细胞白血病患者(志愿者，包括44例b-all初诊者(初诊组)、38例缓解者(缓解组))及其他志愿者(28例健康人，正常组)进行检测。其中，b-all初诊者的入选标准为未经过治疗的确诊为b系急性淋巴细胞白血病的成人(大于等于18岁)患者；缓解者的入选标准为在北京大学人民医院治疗后骨髓像中原始及幼稚淋巴细胞计数小于等于5％的成人(大于等于18岁)患者；正常组的入选标准为无血液系统疾病的正常成人(大于等于18岁)。具体检测步骤如下：
1、参照实施例2步骤二在无菌条件下提取各个志愿者的骨髓标本的rna(或外周血标本的rna也可)，反转录为cdna。
2、以步骤1提取得到的cdna为模板，用特异性引物对甲和探针甲在荧光实时定量pcr仪(美国abi公司7500-fast型)上进行rq-pcr；以步骤1提取得到的cdna为模板，用特异性引物对乙和探针乙在荧光实时定量pcr仪(美国abi公司7500-fast型)上进行rq-pcr。分析每批rq-pcr结果时阈值均固定为0.082。
pcr反应体系和pcr反应条件同实施例1步骤二。
以kiaa0125基因的表达水平与abl1基因的表达水平的比值表示kiaa0125基因的相对表达水平(％)。
结果见图2所示，可以看出，在28例健康人组成的正常组中kiaa0125基因的相对表达水平中位值为63.5％(范围为25.3-128.2％)；38例缓解者组成的缓解组中kiaa0125基因的相对表达水平中位值19.3％(范围为3.1-81.8％)；而44例b-all初诊者组成的初诊组中kiaa0125基因的相对表达水平中位值为1.2％(范围为0.08-22.0％)。统计结果显示，初诊组及缓解组kiaa0125基因的相对表达水平与正常组相比均显著下降(p<0.05)，其中初诊组kiaa0125基因的相对表达水平与缓解组相比亦显著下降(p<0.05)，表明kiaa0125基因的表达水平可以用于预测急性淋巴细胞白血病患者的发生和病程进展。
因此，可以确定，利用实施例1的成套试剂以及kiaa0125基因的相对表达水平可以辅助鉴定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病，或，预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险，或预测急性淋巴细胞白血病的治疗效果。
具体的，确定待测对象是否患有急性淋巴细胞白血病的方法如下：以abl1基因为内参，当待测对象的kiaa0125基因的相对表达水平≤23.6％时，该待测对象患有急性淋巴细胞白血病；当待测对象的kiaa0125基因的相对表达水平>23.6％时，该待测对象不患有急性淋巴细胞白血病。
预测待测对象患急性淋巴细胞白血病的风险的方法如下：待测对象kiaa0125基因的相对表达水平越低，患急性淋巴细胞白血病的风险越高；待测对象kiaa0125基因的相对表达水平越高，患急性淋巴细胞白血病的风险越低。
预测待测急性淋巴细胞白血病患者的治疗效果的方法如下：待测患者kiaa0125基因的相对表达水平越低，治疗效果越差；待测患者kiaa0125基因的相对表达水平越高，治疗效果越好。
<110>北京大学人民医院
<120>检测kiaa0125基因表达水平的物质在辅助鉴定急性淋巴细胞白血病中的应用
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