本发明属于分子生物学及遗传育种
技术领域：
，更具体涉及用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物及应用。
背景技术：
中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃遗传资源的原始起源中心。近年来，我国猕猴桃产业稳步扩增，截至2017年全国栽培面积达240万亩，产量290万吨，均居世界首位。在品种格局上，我国立足于本土猕猴桃遗传资源研究，选育出了‘金艳’、‘东红’等猕猴桃新品种，在全球范围广泛栽培，彻底改变了世界猕猴桃产业唯‘海沃德’品种的单一格局，推动了猕猴桃市场多样化和消费的多元化。随着猕猴桃新品种的日益推出，新品种的鉴定是亟待解决的一大难题。目前，对猕猴桃专利品种的鉴定仅通过树势、叶片形态、花期、花形态、果实外观等传统手段，难免受到环境和其他人为因素的影响。对猕猴桃品种的不确定性，限制了产业的健康持续发展，且苗木品种不纯甚至错误将造成果农经济效益严重受损。分子标记技术能快速、准确、高效对品种进行鉴定,对保证农业生产中品种的正确性具有重要的意义。选择适宜的分子标记及其配套检测技术,建立一套简便、经济、准确而高效的品种鉴定和指纹图谱技术体系,是打击假冒伪劣种苗、保护植物遗传育种工作者和农民的合法权益，规范我国农业市场的迫切需要。分子标记技术通过检测生物个体在基因组上产生的变异，从而对不同个体进行区分，是继形态标记和生化标记之后，发展的一种较为理想的遗传标记。在植物种质资源鉴定及育种中，对分子标记的应用已日趋成熟。ssr分子标记数量丰富且随机均匀分布于基因组，呈共显性，等位变异高，操作简便且稳定性好，已应用于大豆、苹果和葡萄等品种鉴定方面。在猕猴桃中，分子标记技术应用于猕猴桃雄性系列品种的鉴定，已为多个优异猕猴桃品种准确提供授粉雄株，提升猕猴桃的育种效率。‘东红’猕猴桃单果重在80-130克，果实为短圆柱形，果皮无毛绿褐色，果肉多汁，酸甜适中。总糖含量高达13.45﹪，而总酸只有0.49﹪，可溶性固形物16.5﹪，富含钙、铁、钾等多种矿物质及17种氨基酸。开发适用于猕猴桃‘东红’品种的分子鉴定标记，有利于从分子水平上明确界定专利品种，利于对猕猴桃品种进行鉴定和品种保护。技术实现要素：本发明的目的在于利用分子标记技术，提供一种用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物，所述的分子标记命名为geo19-159，针对其设计的引物为geo19-159-f:tgattcgttttgacacaatgg和geo19-159-r:tgcaggctatggactgagtg。本发明的另一个目的在于提供了用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过ssrfinder软件在全基因组范围内开发ssr标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计ssr标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东红’品种进行pcr扩增，筛选得到分子标记geo19-159，针对其设计的引物为geo19-159-f:tgattcgttttgacacaatgg和geo19-159-r:tgcaggctatggactgagtg。用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在猕猴桃育种中的应用，包括利用本发明的引物用于猕猴桃育种，或是利用本发明的引物对猕猴桃品种，特别是‘东红’品种进行鉴定，仅‘东红’猕猴桃可特异性的扩增得280bp和282bp的片段，或是根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘楚红’、‘gt815’、‘h-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘qs-5’、‘通山5号’、‘wh-1’或‘厦亚1号’猕猴桃进行区分。与现有技术相比，本发明的优点：1.形态标记简单直观，但是数量少、多态性差、易受环境条件影响。分子标记操作简便，在植物体的各个组织和发育时期，均可检测，不受季节和环境限制。数量多，遍及整个基因组。多态性高，品种间存在许多等位变异。2.本发明的引物可在猕猴桃系列品种中扩增得到不同大小的dna片段。该分子标记扩增稳定性，能用于进行猕猴桃‘东红’品种的鉴定。3.本发明提供的分子标记引物特异性高，适用范围广，可从40多个不同品种的猕猴桃中对‘东红’品种进行鉴定，利用分子标记geo19-159引物对‘东红’dna进行扩增，仅东红可特异性的扩增出280bp和282bp的条带。4.除了根据特异性条带鉴定‘东红’品种，还可根据条带大小和数目对‘楚红’、‘gt815’、‘h-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘qs-5’、‘通山5号’、‘wh-1’或‘厦亚1号’猕猴桃进行区分。具体实施方式本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。实施例1：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物的获得：申请人从猕猴桃基因组序列网站(http://bioinfo.bti.cornell.edu/kiwi)下载‘红阳’猕猴桃全基因序列。通过ssrfinder软件在全基因组范围内开发ssr标记，根据基因结构注释结果，选择基因位点设计ssr标记引物。利用设计合成的引物，对猕猴桃‘东红’品种进行pcr扩增，筛选得到分子标记geo19-159，针对其设计的引物为geo19-159-f:tgattcgttttgacacaatgg和geo19-159-r:tgcaggctatggactgagtg。实施例2：用于猕猴桃‘东红’品种鉴定的分子标记引物在品种鉴定中的应用：(1)按照ctab法分别提取40多个不同品种猕猴桃的dna样品(具体品种名称如表1所示)。(2)使用加样器吸取990ulhidi和10ulrox500或liz500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10ul。(3)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。(4)在96孔板对应的孔中分别加入各样本dna，每个样品50pg。(5)参照以下pcr反应体系加入相应试剂到96孔板，使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。按照以下程序进行pcr反应。a.pcr反应体系25μl体系的配制所述的引物f和引物r为：geo19-159-f:tgattcgttttgacacaatgg和geo19-159-r:tgcaggctatggactgagtg。b.pcr反应条件(6)程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却，再将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。(7)使用3730xl测序分析仪(美国abi公司)检测扩增片段。(8)使用genemapper软件分析ssr扩增数据，利用str毛细管电泳检测扩增片段峰，横坐标为片段大小，纵坐标为荧光强度值。(9)利用标记geo19-159扩增猕猴桃品种，仅‘东红’猕猴桃扩增得到280bp和282bp的特异条带，同时根据不同条带的大小和数目，对不同品种包括：‘楚红’、‘gt815’、‘h-15’、‘华光2号’、‘华优’、‘海沃德’、‘龙山红’、‘满天红’、‘磨山雄5号’、‘秦美’、‘qs-5’、‘通山5号’、‘wh-1’或‘厦亚1号’猕猴桃进行区分。具体扩增结果如表1所示。表1不同品种猕猴桃名称及geo19-159引物pcr扩增结果品种名称分析结果品种名称分析结果布鲁诺276bp魁蜜288bp川猕3号288bp龙山红292bp楚红274bp、276bp满天红278bp、282bp翠玉276bpmbr288bp、290bp东红280bp、282bp米良1号288bp丰悦288bp磨山4号276bp、284bpgt815274bp、276bp、282bp磨山雄5号286bp、290bp贵长276bp、282bp庆元秋翠288bp桂海4号284bp、288bp秦美278bp、286bp、288bph-15278bp、280bpqs-5288bp、298bpyx-h8288bp通山5号278bp华光2号288bp、292bpwh-1286bp华优276bp、288bp武植3号288bp海沃德274bp湘麻6号276bp金魁278bp、286bp厦亚1号276bp、282bp、284bp金梅274bp、280bp新观2号284bp、288bp金农276bp、282bp西选1号278bp、286bp金桃274bp、280bp徐香288bp金霞288bp豫皇一号276bp、284bp金艳274bp、280bp早鲜288bp、290bp金玉288bp江山娇276bp金圆274bp、280bp序列表<110>中国科学院武汉植物园<120>用于猕猴桃东红品种鉴定的分子标记引物及应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgattcgttttgacacaatgg21<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2tgcaggctatggactgagtg20当前第1页12