利用碱基编辑技术实现基因敲除的方法及其应用与流程

文档序号：15857286发布日期：2018-11-07 11:12阅读：1819来源：国知局

本发明涉及基因敲除策略，更具体来说，涉及基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用。

背景技术

随着高通量测序的发展，后基因组时代已经来临，如何阅读基因组这部天书，是摆在生物领域的一大课题。开发更加安全，高效，实用性强的基因编辑工具将有助于我们对基因功能的理解。传统的真核生物靶向基因操作是通过全能胚胎干细胞的同源重组和囊胚注射实现的，但目前这种技术只是在小鼠等有限的物种上实现了。除此之外，体细胞的基因改造和核移植也是一种基因靶向操作的途径，但目前尚存在一些缺陷。

可编程核酸内切酶技术包括锌指核酸酶(zinc-fingernucleases,zfns)技术和转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectorsnucleases,talens)技术，以及规律成簇间隔短回文重复系统(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat；crispr-associated，crispr/cas9)，三种技术的发明与应用彻底改变了传统基因靶向技术的低效与应用范围狭窄的弊端。特别是crispr/cas9技术，由于其简便、高效、价廉，并且可以在体细胞、生殖细胞、胚胎以及活体中高效使用，使得其出现之后立即席卷全球，成为了基因编辑领域最新，但发展最快、应用最广的技术，引发了基因编辑领域的革命。目前，crisrp/cas9已经广泛应用于包括dna敲除、dna敲入、dna替代、dna修饰、rna修饰、dna标记、基因转录调节等多个领域。

利用crispr/cas9进行基因编辑主要是利用了该系统的两种特性：1、靶向性。利用sgrna通过靶序列互补，将cas9-sgrna的复合体定位到目标序列。2、内切酶活性。cas9蛋白是一种核酸内切酶，含有两个活性域，可以分别切割dna的两条链。这样就造成了dna双链的断裂(double-strandbreaks,dsb)，在没有模板的条件下，发生非同源末端连接(non-homologousendjoining,nhej)修复，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除(knockout)。在有模板的条件下，通过同源重组进行修复(homology-directedrepair,hdr)，实现基因敲入(knockin)。利用crispr/cas9实现基因编辑受到多种因素的控制，其也容易引起一些脱靶效应及一些毒性。碱基编辑系统是在crispr/cas9的基础上改造过来的，是将脱氨酶融合到了cas9酶之上，实现靶位点的编辑。目前碱基编辑存在多个版本，但效率最高、应用最广的是be3及其变体和abe系统，其分别可以实现c到t和a到g的转换。利用be3，可以对编码基因的cds进行改造，人为制造终止密码子，进而实现目的基因的敲除。这种系统不需要造成dna双链的断裂，相对crispr/cas9敲除基因的特点，碱基编辑系统更加安全、高效，将是一种应用性更强的技术。现有的be3系统实现编码基因的敲除，利用的是脱氨酶rapobec1将靶位点上的胞嘧啶(c)脱氨生成尿嘧啶(u)，进而转换成胸腺嘧啶(t)。该系统虽然可以较为高效的生成终止密码子，但对于原代细胞和高甲基化位点的作用效果还有待提高。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效精准的基因敲除策略。

发明人通过改变be3碱基编辑系统上的脱氨酶，将rapobec1替换成人源的phrbn(apobec-3a)，生成新的碱基编辑工具，h-phrbn-be。利用h-phrbn-be介导的单碱基编辑的精确性和特异性而实现基因敲除：通过c-t突变引入终止密码子，例如将caa、cag或cga突变成终止密码子taa、tag或tga(或通过dna互补链的g-a突变将tgg突变成终止密码子taa、tga或tag)来终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。实验结果表明：相对be3，h-phrbn-be的编辑窗口变为了3-8位内的胞嘧啶，突变的c不受其前面g碱基的影响，同时该系统对原代细胞和高甲基化位点仍然保持较高效率。

根据本发明的第一方面，提供了一种基因敲除方法，其包括：

选定待敲除基因的编码区(cds区)的20bp–ngg目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga；

利用sgrna序列来将h-phrbn-be定位到目标序列以使目标密码子中的目标单碱基c变成t从而相应引入终止密码子taa、tag或tga以实现基因敲除，其中目标单碱基c位于目标序列(左端)的3-8位；phrbn是来自人的碱基编辑酶phrbn(apobec-3a)，通过将phrbn融合到切口酶形式的cas9核酸酶(d10a)的n端而靶向目标单碱基c，

所述sgrna序列为与目标序列互补对应的20bp序列。

可替代地，在上述方法中，也可选定待敲除基因的编码区的ccn-20bp目标序列(pam序列)，使其包含完整的目标密码子tgg；相应地，目标单碱基g位于目标序列(右端)的第3-8位。

根据本发明，be3可以选自：phrbn-spcas9-ugi-nls；以及phrbn-xcas9-ugi-nls。

根据本发明的方法可以用于敲除如下十一个靶基因：人gatad2a、ndufaf1、pd1、lag3、tigit、vista、fancf、dnmt1、cftr以及小鼠tim3和lag3，与其相应的sgrna序列分别与序列一至十一所示目标基因序列互补。

根据本发明的第二方面，提供了上述方法在细胞系hek293t中进行人gatad2a、ndufaf1、pd1、lag3、tigit、vista、fancf、dnmt1和cftr基因敲除的应用。

根据本发明的第三方面，提供了上述方法在人t细胞中进行pd1、lag3、tigit、vista基因敲除的应用。

根据本发明的第四方面，提供了上述方法在鼠胚胎成纤维细胞中进行鼠tim3和lag3基因敲除的应用。

根据本发明的第五方面提供了根据上述应用而获得的分离的细胞系、原代细胞或它们的次代培养物。

根据本发明的第六方面提供了一种用于基因敲除的试剂盒，包括(与待敲除基因相应的)上述sgrna、h-phrbn-be以及扩增试剂。

本发明利用crispr/cas9基础上发展的碱基编辑技术，通过更加精准的ct或ga单碱基突变创造终止密码子，从而建立了比crispr/cas9更高效、更精确以及更少脱靶效应的基因敲除策略。

附图说明

图1为利用h-phrbn-be系统通过ct突变实现目标基因被敲除的示意图；

图2为人细胞中实现基因敲除的sanger测序图谱；

图3为在高甲基化区域进行碱基编辑的ta克隆结果；

图4为靶位点c前面为g时碱基编辑的ta克隆结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅用于说明本发明的一部分实施例，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以上所述仅为本发明较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

首先，构建不同形式的h-phrbn-be，即phrbn-spcas9-ugi-nls；phrbn-xcas9-ugi-nls。其中phrbn-spcas9-ugi-nls是根据原始载体be3(addgene:73021)改造而成，phrbn-xcas9-ugi-nls根据原始载体xcas9-be3(addgene:108380)改造而成。

1、phrbn的合成。

来自人源的phrbn(seqidno.1)序列由生工生物(http://www.sangon.com/)合成。所合成片段的两端分别加有noti和smai的酶切位点。合成的片段克隆到常用的pmd19t载体(takara:3271)上。

2、载体的酶切与纯化

be3和xcas9-be3载体经过noti(neb:r0189l)、smai(neb:r0141l)酶切，体系如下：buffer(neb:r0189l)6μl；质粒2μg；noti1μl；smai1μl；ddh2o补齐到60μl。混样后于37℃过夜酶切。

酶切产物经过1％的琼脂糖凝胶，进行回收(axygen:ap-gx-250g)。其中be3回收大片段的骨架载体，合成载体回收phrbn的小片段载体。回收按照试剂盒的使用说明进行(axygen:ap-pcr-250g)。回收后的片段经过nanodrop2000检测浓度。

3、载体的连接、转化与质粒提取。

回收的骨架载体和phrbn片段经过连接，连接体系如下：t4连接buffer(neb:m0202l)1μl，骨架载体20ng，phrbn片段50ng，t4连接酶(neb:m0202l)0.5μl，ddh2o补齐到10μl，16℃连接过夜。转化步骤如下：取20μl感受态细胞(transgen:cd201)在冰上解冻；2μl的连接产物与感受态细胞混合，冰上放置20分钟；42℃热激60秒；冰上放置2分钟，加入400μl复苏lb培养基(mdbio:l001-1kg)，摇床30分钟；取70μl涂氨苄平板(50μg/ml，37℃培养箱，培养14个小时。

挑选单克隆菌，在4ml液体lb培养基中扩大培养，14小时后提取质粒(axygene:ap-mn-p-250g)。步骤如下：菌液经过4000转/分钟离心10分钟，倒掉上清培养基；加入350μl的buffers1，将菌体吹散，转移到2ml离心管中；加入250μl的buffers2，上下颠倒8次；加入250μl的buffers3，颠倒混匀6次，产生沉淀；12000转/分钟离心10分钟，取上清过柱；离心1分钟，倒掉废液，加入500μl的w1，离心一分钟，倒掉废液；加入750μl的w2，离心，倒掉上清；加入500μl的w2，离心，倒掉上清；空转1分钟；加入50μl的洗脱液，静置2分钟，离心。获得质粒经过浓度检测，取10μl送测序，阳性质粒保存在-20℃。

最终构建成如下两种h-phrbn-be：

(1)phrbn-spcas9-ugi-nls，seqidno.2；

(2)phrbn-xcas9-ugi-nls，seqidno.3；

在下面进行基因敲除时，可以采用上述任一种h-phrbn-be，优选为(1)。

接下来进行sgrna的设计。碱基定点编辑是利用sgrna将h-phrbn-be定位到靶向特异靶位点，靶基因特异性sgrna的选择和设计是本发明的关键之处。本发明如下选择设计sgrna：

选定待敲除基因编码区的20bp–ngg目标序列，使其包含完整的目标密码子caa、cag或cga。或编码区的ccn-20bp目标序列，使其包含完整的目标密码子tgg。目标单碱基c位于目标序列的第3-8位。所述sgrna序列为与目标序列互补对应的20bp序列。

针对如下十一个靶基因：人gatad2a、ndufaf1、pd1、lag3、tigit、vista、fancf、dnmt1、cftr以及小鼠tim3和lag3。本发明选定下述目标基因序列来设计相应的sgrna(粗体下划表示pam；斜体下划表示候选突变编码子)：

一.hgatad2a

sg-1:(seqidno.4)

sg-2:(seqidno.5)

二.hndufaf1

sg-1:(seqidno.6)

三.hpd1

sg-1:(seqidno.7)

四.hlag3

sg-1:(seqidno.8)

五.htight

sg-1:(seqidno.9)

六.hvista

sg-1:(seqidno.10)

七.hfancf

sg-1:(seqidno.11)

sg-2:(seqidno.12)

sg-3:(seqidno.13)

八.hdnmt1

sg-1:(seqidno.14)

sg-2:(seqidno.15)

九.hcftr

sg-1:(seqidno.16)

sg-2:(seqidno.17)

十.mtim3

sg-1:(seqidno.18)

十一.mlag3

sg-1:(seqidno.19)

图1为本发明通过ct突变实现目标基因被敲除的示意图。

实施例1

在人细胞株上进行h-phrbn-be介导的碱基编辑，引入终止密码子，实现基因敲除。按常规操作，进行细胞株的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。本实施例选择seqidno.4-seqidno.10为例进行说明。

1.1、质粒构建

对选择的6个人相关基因sgrna，取pam序列前面20bp序列，合成oligo，其中上游序列加上5’-accg-3’，反向互补序列加上5’-aaac-3’，上下游序列通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；holdat4℃)退火，连接到经过bsai(neb:r0539l)线性化的pgl3-u6sgrna(addgene:51133)载体上。线性化体系如下所示：pgl3-u6sgrna2μg；buffer(neb:r0539l)6μl；bsai2μl；ddh2o补齐到60μl。37℃酶切过夜。连接体系如下：t4连接buffer(neb:m0202l)1μl，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μm)5μl，t4连接酶(neb:m0202l)0.5μl，ddh2o补齐到10μl.16℃连接过夜。连接的载体通过转化，挑菌，鉴定，鉴定引物为u6载体为上游序列：5’-tttcccatgattccttcata-3’(seqidno.20)，下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(axygene:ap-mn-p-250g)测定浓度备用。

1.2、细胞的培养与电转

(1)以hek293t细胞(购自atcc)为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：hek293t细胞接种培养于添加10％fbs的dmem高糖培养液中(hyclone,sh30022.01b),其中含penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。

(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen:11668-019)的操作手册，将2μgh-phrbn-be质粒与1μg相应的pgl3-u6sgrna质粒混匀,共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。

(4)对收集到的细胞进行pcr产物测序，发现存在突变的双峰(图2)。

结果表明：靶基因发生了sgrna靶向的碱基突变，引入了终止密码子，pd1、lag3、tigit、vista、2b4、cd160等基因敲除成功。

实施例2

be3系统目前存在的问题一个在高甲基化位点效率偏低，而h-phrbn-be在高甲基化位点仍然展现较高活性，因此我们选择了甲基化高的fancf位点设计了三个sgrna(seqidno.11-seqidno.13)，用来比较be3和h-phrbn-be对基因敲除的效率高低。按常规操作，进行细胞株的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。

1.1、质粒构建

1.2、细胞的培养与电转

(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent(invitrogen:11668-019)的操作手册，将2μgh-phrbn-be或be3质粒与1μg相应的pgl3-u6sgrna质粒混匀,共转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，72小时后收取细胞。

(4)收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。对目的片段进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物。获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：700-800ngpcr回收产物；5μl10xbuffer(mg2+plus)；4μldntp；0.5μlrtaq(takara,r001am)；补水至50μl体系。72℃孵育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。挑取单克隆，用通用引物m13-f测序各靶基因突变。图3结果显示，h-phrbn-be系统相比be3对此类高甲基化位点展示出了更高的编辑效率。

实施例3

be3系统目前存在的另一个问题是靶位点c的编辑效率受到前面g的影响，即c前面若是g，编辑效率大大降低，而h-phrbn-be系统不存在这样的问题，因此我们选择了两个基因，共设计了四个sgrna(seqidno.14-seqidno.17)，用来比较be3和h-phrbn-be对基因敲除的效率高低。按常规操作，进行细胞株的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。

1.1、质粒构建

1.2、细胞的培养与电转

(2)在转染前分至6孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(4)收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。对目的片段进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物。获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：700-800ngpcr回收产物；5μl10xbuffer(mg2+plus)；4μldntp；0.5μlrtaq(takara,r001am)；补水至50μl体系。72℃孵育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。挑取单克隆，用通用引物m13-f测序各靶基因突变。图4结果显示，h-phrbn-be系统相比be3对这类高甲基化位点展示出了更高的编辑效率。

实施例4

在原代细胞上进行h-phrbn-be介导的碱基编辑，引入终止密码子，实现基因敲除。按常规操作，以人的t细胞进原代细胞的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以电转为例。

2.1、pbmc细胞的分离纯化：

(1)用抗凝管采集外周血，边采集边摇晃使外周血与抗凝剂充分混合；

(2)外周血细胞与淋巴细胞分离液(solarbio:p8610)等体积混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；

(3)将得到的白膜层细胞与pbs或者无血清细胞培养基1640(thermofisher:61870)混合后离心，沉淀即为所述pbmc细胞。

重复三遍。

2.2、cd3阳性细胞的富集

(1)调整pbmc细胞浓度至5x10⁷cell/ml。

(2)按每1ml加入cd3+enrichedantibodiescocktail50μl(ebioscience:16-0037-85)，混匀后室温静置5分钟。

(3)按每1ml加入magnet150μl，混匀后室温静置10分钟，

(4)将离心管置于磁力架上静置5分钟，吸取上层细胞悬液至新的15ml离心管中。

(5)重复该操作一次。

(6)室温离心300g，10分钟，收集细胞。

(7)细胞计数。

2.3、cd3阳性细胞的电转

(1)配置电转体系

向1.5ml离心管中分别加入8μgh-phrbn-be质粒与8μgpgl3-u6-sgrna质粒，并按照lonzaamaxa电转试剂盒说明书(lonza:vvpa-1002)要求，加入82μl电转缓冲液和18μlsupplement1,混匀。

(2)收取2x10⁷个细胞到15ml离心管中，300g离心10分钟，弃掉上清。

(3)以a中配好的质粒电转缓冲液混合物重悬细胞，并转移至电转杯中。

(4)使用仪器lonza2b,u-014程序进行电转。

(5)电转后的细胞迅速转移至提前预热的添加有10％fbs(gibco:10099141)的aim-v培养基(life:0870112d)中，37度5％二氧化碳培养箱中培养2小时。

(6)电转后的细胞全换液，以1x10⁶个/ml的密度重悬细胞，培养过夜。

2.4、t细胞的激活培养

(1)电转培养24小时后，向培养基中加入100u/mlil-2(peprotech:200-02-1000)，并按照1:1的比例加入cd3/cd28dynabeads(life:11132d)，激活t细胞。

(2)每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

(3)激活5天后，将t细胞收集到15ml离心管中，并将离心管置于磁力架中，慢慢将上清转移到另外一个干净的15ml离心管中，重复此步骤一次。

(4)室温离心300g，10分钟，弃上清，使用10％fbs，300u/mlil-2aim-v培养基重悬细胞，密度控制在1x10⁶个/ml。

(5)每两天对细胞半换液，或者是补加il-2，并计数，细胞密度始终维持在1x10⁶个/ml。

2.5、基因型分析

(1)收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。

(2)对目的片段进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物。获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：700-800ngpcr回收产物；5μl10xbuffer(mg2+plus)；4μldntp；0.5μlrtaq(takara,r001am)；补水至50μl体系。72℃孵育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。

(3)挑取单克隆，用通用引物m13-f测序t细胞各靶基因突变，测序结果如下(粗体下划表示pam；斜体表示候选突变编码子；斜体下划表示突变碱基)：

1.hpd1

sg-1:

mut:

2.hlag3

sg-1:

mut:

3.htight

sg-1:

mut:

4.hvista

sg-1:

mut:

结果表明：靶基因发生了sgrna靶向的碱基突变，引入了终止密码子，pd1、lag3、tigit、vista等基因敲除成功。

实施例5

在小鼠胚胎成纤维细胞中实现基因敲除

3.1、质粒构建

对选择的2个小鼠相关基因sgrna，取pam序列前面20bp序列，合成oligo，其中上游序列加上5’-accg-3’，反向互补序列加上5’-aaac-3’，上下游序列通过程序(95℃，5min；95℃-85℃at-2℃/s；85℃-25℃at-0.1℃/s；holdat4℃)退火，连接到经过bsai(neb:r0539l)线性化的pgl3-u6sgrna(addgene:51133)载体上。线性化体系如下所示：pgl3-u6sgrna2μg；buffer(neb:r0539l)6μl；bsai2μl；ddh2o补齐到60μl。37℃酶切过夜。连接体系如下：t4连接buffer(neb:m0202l)1μl，线性化载体20ng，退火的oligo片段(10μm)5μl，t4连接酶(neb:m0202l)0.5μl，ddh2o补齐到10μl。16℃连接过夜。连接的载体通过转化、挑菌、鉴定，鉴定引物为u6载体为上游序列：5’-tttcccatgattccttcata-3’(seqidno.20)，下游序列为相应oligo的下游序列。对阳性克隆摇菌提取质粒(axygene:ap-mn-p-250g)测定浓度备用。

3.2、小鼠胚胎成纤维细胞的培养

(1)处死孕鼠，全身置于75％酒精里浸泡，超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有d-pbs(碧云天：c0221d)的玻璃平皿中，冲洗去血。

(2)用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后夹掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30mld-pbs的50ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉d-pbs，再重复此步骤一次，然后将胚胎转移到另一装有d-pbs的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

(3)用200μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶(life:25200072)重悬沉淀，37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

(4)将上层细胞悬液倒入一个装有10mlmef生长培养基(10％fbs)的50ml离心管中，用200目的尼龙网(上海生工:f613461)过滤后，以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30mlmef生长培养基洗涤两次。

(5)细胞沉淀用15mlmef生长培养基重悬后进行细胞计数。

3.3、胚胎成纤维细胞的电转

转染前两个小时换成无抗生素的培养基，利用lonza转染试剂(lonza:v4xp-4012)按照说明书转染，细胞通过计数得1x10⁶个。将h-phrbn-be和sgrna质粒按照3μg，1.5μg的质量混合。电转程序采用cz-167，电转后的细胞在6cm的平皿中培养两天。

3.4、基因型分析

(1)收取部分细胞在裂解液(10μmtris-hcl,0.4mnacl,2μmedta,1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后,酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。

(2)对目的片段进行pcr扩增，用axypreppcrcleanup纯化获得pcr回收产物。获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：700-800ngpcr回收产物；5μl10xbuffer(mg²⁺plus)；4μldntp；0.5μlrtaq(takara,r001am)；补水至50μl体系。72℃孵育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector(takara,3271)连接并转化dh5感受态细胞(transgen,cd201)。

(3)挑取单克隆，用通用引物m13-f测序t细胞各靶基因突变，测序结果如下(粗体下划表示pam；斜体表示候选突变编码子；斜体下划表示突变碱基)：

1.mtim3

sg-1:

mut:

2.mlag3

sg-1:

mut:

上述结果确证tim3和lag3的ct突变和终止密码子的引入。

序列表

<110>李广磊

<120>利用碱基编辑技术实现基因敲除的方法及其应用

<141>2018-06-20

<160>20

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>597

<212>dna

<213>人工序列()

<400>1

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