本发明属于生物技术领域，具体涉及一种gii.2型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
背景技术：
诺如病毒是全球急性胃肠炎的重要非细菌性病原，可感染各年龄段人群。目前每年在全球各地会发生约6.8亿人次的诺如病毒感染，在发展中国家还引起了20万例以上的5岁以下儿童死亡，增加了至少42亿美元的治疗成本以及造成603亿美元的社会经济损失。随着我国食品安全监管体制及公共卫生系统的改善，近年来诺如病毒在许多省市被发现是引起群体中毒的主要食源性病原，对食品安全和公共卫生工作造成了极大威胁。然而合适感染模型的长期缺乏阻碍了对这种病毒的全面认识，至今仍没有有效的病毒防控策略和抗病毒手段。
诺如病毒根据其衣壳蛋白vp1的氨基酸序列，可以被分为六个基因组(genogroup)gi-gvi，其中gi、gii和gvi可以感染人类。同一基因组内的诺如病毒还可以进一步分成不同的基因型，例如gi包括了至少9种基因型，gii包括了22种基因型。gii.4型诺如病毒是全球的主要流行基因型，约80％的诺如病毒感染是由该型别毒株引起的。然而，其他基因型也在病毒监测及疫情暴发中被发现，例如gii.2型、gii.3型、gii.6型及gi基因组等。
近年来，尽管人源诺如病毒体外培养方面的研究有了突破性进展，但是合适的复制体系仍然缺乏；尤其是诺如病毒极易变异，因此，持续监测病毒流行水平及变异情况仍是认识病毒的重要基础。基因组信息的获得为诺如病毒研究提供了重要的基础数据。诺如病毒基因组长约7.5-7.8kb，包括3个开放阅读框。我们前期工作中针对gii.4型、gii.17型诺如病毒以及gii.p12/gii.3重组型诺如病毒建立的“4+1+1”扩增策略具有操作简单、周期短、成本低以及灵敏度高的特点，因此，根据这种新颖的扩增策略，我们研发了一种针对gii.2型诺如病毒的基因组扩增引物和扩增方法，为积累我国gii.2型诺如病毒基因组资源提供了一个有力的研究工具。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种gii.2型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法。
具体地，本发明提供的gii.2型诺如病毒基因组扩增引物，包括六对扩增引物和两条基因组末端的测序引物：
引物对1：ii-1f：5'-gtgaatgaagatggcgtctaac-3'；
ii.2-1r：5'-gtcaactccattccgtggga-3'；
引物对2：ii.2-2f：5'-agcctacatgaagaccttggac-3'；
ii.2-2r：5'-gctctttcttccttgcgttg-3'；
引物对3：ii.2-3f：5'-cacggcattctcaagcaaag-3'；
ii.2-3r：5'-tcgtccatcaaaccgccaaa-3'；
引物对4：ii.2-4f：5'-gagcactggaatggggaatc-3'；
ii-4r：5'-ccrccngcatrhccrttrtacat-3'；
引物对5：ii-5f：5'-ggagggcgatcgcaatc-3'；
ii-5r：5'-ccrgcraagaaagctccagccat-3'；
引物对6：ii.2-6f：5'-aaattcaccccagttggac-3'；
ii.2-6r：5'-tcactaagcttgtgactcc-3'；
测序引物：ii.2-seq1r：5'-gccctctttccacatacagtcc-3'；
ii.2-seq6f：5'-tgaatgcgcccatgacacag-3'。
r代表a/g，h代表a/c/t，n代表碱基a/c/t/g。
本发明还提供一种gii.2型诺如病毒基因组扩增方法，具体为：分别以上述的引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r作为扩增引物的上下游引物，以gii.2型诺如病毒的rna为模板进行rt-pcr扩增，分别得到扩增产物，然后采用以上每对扩增引物和测序引物ii.2-seq1r、ii.2-seq6f分别对相对应扩增出的扩增产物进行核酸序列测序，再通过拼接比对，获得gii.2型诺如病毒基因组全长序列。
进一步地，所述的rt-pcr，其反应体系为：含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，rna模板2μl，其余由双蒸水补足至20μl；反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，最后72℃延伸7min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对常见的gii.2型诺如病毒基因型，采用覆盖整个基因组的“4+1+1”的分段扩增策略，通过应用于实际检出样本的扩增、测序及序列拼接，从而获得gii.2型诺如病毒基因组序列。利用本发明提供的引物对gii.2型诺如病毒进行扩增和测序的方法具有效率高、操作简单、周期短、成本低、易推广等特点，可广泛应用于医疗卫生、检验检疫等具有诺如病毒检测需求的机构以及相应的科研领域。
附图说明：
图1为gii.2型诺如病毒基因组扩增策略与相应引物的设计位置。
图2为适用于gii.2型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr退火温度优化，电泳顺序为m，1-28，其中m为dnaladder，1-4、5-8、9-12、13-16、17-20、21-24、25-28分别为基因组扩增引物ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r及检测引物g2skf/g2skr在不同退火温度(依次为45℃、50℃、55℃、60℃)下扩增产物的电泳结果。
图3为适用于gii.2型诺如病毒基因组扩增的rt-pcr引物浓度优化，图a-图f分别为引物ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的优化结果，电泳顺序为m，1-9，其中m为dnaladder，1-3为0.2μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果，4-6为0.6μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果，7-9为1.0μl引物分别扩增以rna原液、rna原液稀释10倍、rna原液稀释100倍为模板的电泳结果。
图4为gii.2型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr灵敏度评价，电泳顺序为m，1-35，其中m为dnaladder，1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35分别为基因组扩增引物ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r和检测引物g2skf/g2skr在病毒rna不同稀释度(依次为101-105倍稀释)下扩增产物的电泳结果。
图5为实际样本中gii.2型诺如病毒基因组的扩增效果，电泳顺序为m，1-6，其中m为dnaladder，1-6为实际样本l335进行扩增基因组6个片段的电泳结果。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1gii.2型诺如病毒基因组的扩增策略及相应引物的设计
gii.2型诺如病毒基因组大小约7.5kb，包括三个orf，其中orf1长约5.1kb，orf2长约1.6kb，orf3长约0.8kb。以一代桑格脱氧核苷酸测序法为基础，设定每个扩增片段大小范围为1.3kb-1.6kb，其中orf1分为4个片段，orf2和orf3均为1个片段。此外，为获得基因组5'和3'端完整序列，分别在基因组两端设计扩增长度在100-800bp的片段，相应引物分别命名为ii.2-seq1r和ii.2-seq6f。具体基因组分段策略及相应引物位置可见图1。
在以上限制条件下，采用oligo软件设计相应的引物，具体引物信息见表1。其中，引物核苷酸序列中的r代表a/g，h代表a/c/t，n代表碱基a/c/t/g。
表1：gii.2型诺如病毒基因组扩增引物及测序引物信息
a引物位置参考gii.2型诺如病毒的代表序列genbank登录号为dq456824。
实施例2适用于gii.2型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr退火温度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(含gii.2型诺如病毒阳性样本l335)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，45-60℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
退火温度分别选择为45℃、50℃、55℃、60℃。
以检测引物g2skf/g2skr(g2skf：5'-cntgggagggcgatcgcaa-3'；g2skr：5'-ccrccngcatrhccrttrtacat-3')作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.2型诺如病毒基因组扩增条带依次为1597bp、1605bp、1515bp、1434bp、1686bp、1244bp。电泳结果如图2，结果表明，六对基因组扩增引物具有较宽的退火温度范围，为减少在实际样本中的非特异扩增，最终选择55℃为应用退火温度。
实施例3适用于gii.2型诺如病毒基因组扩增的rt-pcr引物浓度优化
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(含gii.2型诺如病毒阳性样本l335)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl，并采用无核酸酶的ddh2o进行10×梯度的稀释处理，分别选取rna原液(原液的浓度是104rtpcru)、rna原液稀释10倍和rna原液稀释100倍作为扩增模板。需要注意的是，本发明诺如病毒的含量采用了rtpcru单位来定义，即为采用检测引物g2skf/g2skr，通过标准的rt-pcr方法对10×梯度稀释的病毒液进行检测，则稀释至到恰能检出时的病毒浓度为一个rtpcru。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物分别按不同条件加入0.2μl、0.6μl、1.0μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，不同稀释度样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.2型诺如病毒基因组扩增条带依次为1597bp、1605bp、1515bp、1434bp、1686bp、1244bp。电泳结果如图3，结果表明，片段1扩增引物最优条件为0.6μl、1.0μl，片段2扩增引物最优条件为0.2μl、0.6μl，片段3扩增引物最优条件为0.2μl、0.6μl、1.0μl，片段4扩增引物最优条件为0.6μl、1.0μl，片段5扩增引物最优条件为0.6μl、1.0μl，片段6扩增引物最优条件为0.2μl、0.6μl、1.0μl。综上所述，最终选择0.6μl为各片段扩增体系中引物添加量。
实施例4gii.2型诺如病毒基因组扩增用引物的rt-pcr灵敏度评价
(1)病毒样本处理及核酸提取：通过pbs溶液(depc处理)稀释收集的待处理样品(含gii.2型诺如病毒阳性样本l335)至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl，并采用无核酸酶的ddh2o进行10×梯度的适当稀释(依次为101-105倍稀释)处理。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
以检测引物g2skf/g2skr(g2skf：5'-cntgggagggcgatcgcaa-3'；g2skr：5'-ccrccngcatrhccrttrtacat-3')作为对照，按照上述体系和反应条件进行。
(3)电泳：取扩增产物5μl，1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05％goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果，所述诺如病毒的含量采用检测引物的rtpcru单位来定义，即为采用常用检测引物g2skf/g2skr对进行10×梯度稀释的病毒rna进行检测，则稀释至恰能检出时的病毒浓度为一个rtpcru。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.2型诺如病毒基因组扩增条带依次为1597bp、1605bp、1515bp、1434bp、1686bp、1244bp，电泳结果如图4，结果显示：片段3的扩增引物可以达到常规检测引物的10rtpcru，其余片段的扩增引物可以达到常规检测引物的100rtpcru。
实施例5实际检出样本中gii.2型诺如病毒基因组的扩增效果
(1)病毒样本处理及核酸提取：取gii.2型诺如病毒阳性样本l335，通过pbs溶液(depc处理)稀释待处理样品至10％(w/v)浓度，振荡混匀，于12000×g下离心10min，收集上清液140μl，并通过rna提取试剂盒抽提样本中病毒rna共60μl。
(2)基因组分段扩增法：即分6段扩增，所使用的引物对如下：ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r，每次rt-pcr反应选择一对引物。采用20μl的一步法rt-pcr反应体系，含有2×one-steprt-pcrmixture10μl，10μmol/l上游引物和10μmol/l下游引物各0.6μl，mlv/rnasin/hs-taq酶混合液0.8μl，样本rna模版2μl，其余由ddh2o补足。
反应条件为：50℃反转录30min，94℃预变性3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃75s，共30次循环后，72℃最后延伸7min。
(3)电泳：取扩增产物5μl，采用1.0％的琼脂糖凝胶(含0.05‰goldview核酸染料)进行电泳，并通过凝胶成像系统观察结果。按引物对ii-1f/ii.2-1r、ii.2-2f/ii.2-2r、ii.2-3f/ii.2-3r、ii.2-4f/ii-4r、ii-5f/ii-5r、ii.2-6f/ii.2-6r的顺序，gii.2型诺如病毒基因组扩增条带依次为1597bp、1605bp、1515bp、1434bp、1686bp、1244bp大小附近范围内，电泳结果如图5，结果表明，采用上述扩增引物对样本l335进行扩增均获得成功。
(4)核酸测序与基因组拼接比对：分别采用以上六对扩增引物以及两条测序引物ii.2-seq1r、ii.2-seq6f对相对应扩增出的l335样本的扩增产物测序并拼接，最终获得基因组序列长度为7496bp，其基因组核苷酸序列如seqidno.1所示，将该基因组序列提交进行blast分析，结果表明，与l335样本基因组覆盖度(100％)和相似度(95％)均最高的样本为dq456824/mk04/2004/jp，此外，还存在27条基因组序列的比对覆盖度大于99％，但相似度仅为82-83％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯微生物科技有限公司
<120>一种gii.2型诺如病毒基因组扩增引物和扩增方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7496
<212>dna
<213>诺如病毒gii.2l335(norovirusgii.2l335)
<400>1
gtgaatgaagatggcgtctaacgacgcttctgctgccgctgctgttaacagcaacaacga60
caacacaaaatcttcgaatgacggaatgcttaacaacatggccgtcacccttaaacgagc120
ccttggggcccggcccaaacagccggtcccgagggagaaacccccaagaccccctagacc180
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ggcaccaatcctaggccccgggaatgccccaaagctgagcactaaaaccaagttctggag3660
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