本发明属于油菜分子育种和生物技术领域，具体涉及一种甘蓝型油菜粒重和角果长度性状主效qtl位点的发现，及其紧密连锁的分子标记的开发及应用。、
背景技术：
油菜是我国第一大油料作物，约占世界油菜产量的20％(huetal.,2016)。菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，占国产食用植物油总量的57.2％，在国家食用油供给安全战略中占有十分重要的地位(范成明等，2018)。我国国产植物油对外依存度已超过60％，且有继续增加的趋势(王汉中等，2014)。另外，菜籽油与柴油有较为相近的脂肪酸构成，是一种绿色可再生能源。在我国城镇化规模持续扩大，耕地面积进一步缩小的情形下，提高油菜单位面积产油量(＝单产×含油量)已经成为目前我国油菜生产最为迫切的任务之一，是事关我国油菜产业持续与发展的根本问题。
近年来，我国油菜高油份育种取得突破(傅廷栋等，2014)，而单产只有欧盟的57％，仍然低于世界平均水平且增加速度十分缓慢(http://apps.fas.usda.gov/psdonline/)。这严重影响了农民种植油菜的积极性，限制了油菜的经济效益和油菜产业的国际竞争力。因此，我国油菜单产亟待提高(殷艳和王汉中，2012)。在相同的种植密度下，油菜单产取决于单株产量，而单株产量由三个构成因素(单株角果数、每角粒数和粒重)组成。研究表明油菜单株产量的三个构成因子之间表现出不同程度的负相关，但其相关系数往往不大(白桂萍等，2016)，这说明可以通过提高单个产量构成因子(如粒重)来增加产量。在油菜种质资源中，粒重呈现出很大的自然变异，千粒重极值范围为2-8克(陈苇等，2011；富贵等，2012)。而国家审定油菜品种的千粒重均值只有3克多(张芳等，2012；赵永国等，2015)，这表明现有油菜品种粒重还有较大的提升空间。因此，增加粒重是提高油菜单产的有效途径之一。
随着分子标记技术的不断发展，其在作物中的应用越来越广泛。grodzicker等(1974)创立了限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,rflp)标记技术。rflp是第一代分子标记，具有数量丰富、稳定遗传、专一性、重复性好、共显性等特点。但是，该标记对dna要求量比较大；且操作程序繁琐、耗时费力、周期长；还需要使用放射性同位素对探针进行标记，这些因素都局限了rflp标记的广泛使用。aflp标记结合了pcr和rflp标记技术，在作物遗传多样性研究、细胞学研究、品种纯度鉴定和抗病等研究中得到广泛的应用(宋顺华等，2006；袁素霞，2009；王雪，2004)。但aflp标记也存在一些缺点：成本较高，过程复杂，技术难度大；标记大多为显性标记；对dna质量和限制性内切酶质量要求较高。ssr标记，也叫微卫星dna标记(microsatellitedna)，已经被广泛应用于作物的基因定位、分子标记辅助选择、dna指纹图谱、品种纯度鉴定、种质资源的保存及利用和遗传多样性分析等研究中(陈烨丽，2010；缪体云，2007；荆赞革，2010；王冬梅，2011)。ssr标记具有数量丰富、多态性高、操作简单、成本较低等优点，长期以来被广泛引用于分子标记辅助选择。近十年来，随着测序技术的持续进步，使得基于基因组序列信息的分子标记开发成为可能，如snp标记和indel标记(hytenetal.，2010)。目前，全基因组选择育种芯片还只在水稻中开始尝试(yuetal.,2014)，油菜等其他作物仍以分子标记辅助选择为主。
粒重作为重要的产量构成之一，是由微效多基因控制的数量性状。它的遗传加性效应为主，显性和上位性较弱，因而其杂种优势很弱，具体表现为杂种的粒重一般都介于双亲之间。由于分子标记技术和数量遗传学的发展和结合，人们已可将复杂的数量性状分解为单个的数量性状基因位点(quantitativetraitloci,qtl)，然后像研究质量性状一样对控制数量性状的多个基因进行研究。qtl定位就是在遗传分离群体的基础上，借助分子标记和遗传图谱，利用qtl作图软件对分离群体的数量性状表型数据进行分析，从而确定数量性状基因在染色体上的位置和效应。目前，定位的方法主要有两种连锁作图(linkagemapping)和关联作图(associationmapping)。油菜千粒重的qtl定位研究也有一些报道(quijadaetal.,2006；udalletal.,2006；radoevetal.,2008；shietal.,2009；王峰等，2010；basunandaetal.,2010；fanetal.,2010；zhangetal.,2011；赵卫国等，2017)，但通常检测出的qtl效应值较小且重复性不好，较难在油菜育种中应用。本研究通过多环境qtl定位，旨在筛选到对油菜千粒重具有稳定作用的大效应分子标记，用于油菜产量性状的标记辅助选择。
技术实现要素：
本发明目的是在于提供了一种油菜粒重和角果长度性状的稳定表达的主效qtl位点。该主效qtl位点对粒重和角果长度的贡献率分别超过20％和30％，针对该位点，筛选到与其性状紧密连锁的共显性ssr标记(标记离主效qtl位点的遗传距离很近，<0.1cm)，该分子标记的引物为brsf6-2562-f：tgtttcccctatatatttatttgtggt；brsf6-2562-r:tcaaaataacaacccattcca。
本发明的另一个目的在于提供了一种油菜粒重和角果长度性状紧密连锁的分子标记引物的应用，利用该引物，可用于甘蓝型油菜的育种，特别是中双11号衍生品系的选育提供了便利。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
甘蓝型油菜粒重和角果长度性状主效qtl位点的挖掘：
(1)利用油菜测序品种中双11号和73290杂交，杂种f1代自交产生f2群体及其f2:3和f2:4家系；
(2)采用ctab法(doyleetal.1987)提取亲本中双11和73290及f2群体的叶片dna；
(3)合成自主开发的ssr和snp以及indel引物，并对亲本dna进行pcr扩增，产物在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，染色和显影后对条带的大小进行判别，筛选多态性引物；
(4)利用多态性引物对f2群体进行分子标记分析，获得基因型数据；
(5)把f2群体的基因型数据输入joinmap3.0软件，进行遗传连锁图谱的构建；
(6)f2群体的基因型数据(仅限于定位到遗传图谱上的标记)以及f2群体及其f2:3和f2:4家系的千粒重和角果长度性状均值输入winqtlcart2.5软件进行qtl定位，最终检测到1个同时控制粒重和角果长度的多效性主效qtl位点，该位点与brsf6-2562标记的距离最近(<0.1cm)；
利用上述技术措施，申请人最终获得了一个同时控制甘蓝型油菜粒重和角果长度多效性主效qtl位点，与申请人自主开发的ssr标记brsf6-2562紧密连锁，其引物序列为brsf6-2562-f：tgtttcccctatatatttatttgtggt；brsf6-2562-r:tcaaaataacaacccattcca。利用winqtlcart2.5软件分析测得其对油菜千粒重的贡献率为23.7％，加性效应为-0.28，显性效应为0.09；对油菜角果长度的贡献率为30.2％，加性效应为-6.77，显性效应为0.64。
一种油菜粒重和角果长度性状紧密连锁的分子标记引物的应用，包括利用本发明提供的引物，利用该引物可用于甘蓝型油菜的育种，包括筛选大粒单株，用于甘蓝型油菜的图位克隆或是用于甘蓝型油菜分子标记辅助选择。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明定位了一个新的同时控制千粒重和角果长度的多效性主效qtl位点，分别解释23.7％和30.2％的表型方差。在常规育种方法中，千粒重性状表型鉴定要等到成熟期考种，费时费力且选择效率低下(千粒重表型受环境影响较大)。通过检测千粒重性状主效qtl位点，可以在苗期进行淘汰，不仅节约生产成本而且大大提高选择效率。本发明中千粒重主效qtl位点位置明确，主效qtl位点的检测方法方便快速，不受环境影响。通过检测与千粒重性状相关的分子标记，即可预测千粒重的多少，进而准确快速筛选大粒单株。
附图说明
图1为一种中双11×73290组合，f2群体及其f2:3和f2:4家系在6个环境种植时千粒重和角果长度均值的频率分布图；
结果表明f2群体及其f2:3和f2:4家系的千粒重和角果长度均呈正态分布，证明千粒重和角果长度属于数量性状；图中横坐标代表连锁群，纵坐标代表株系数目。
图2为一种利用分子标记brsf6-2562对f2单株进行基因型分析和筛选示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
油菜千粒重分离群体的构建及性状测定：
本实施例中使用油菜测序品种中双11和另一个遗传差异大的油菜品种73290杂交，杂种f1代自交产生f2群体及其f2:3和f2:4家系。其中，中国农科院油料所阳逻综合试验基地，于2009年种植f2群体，2010，2011和2012年种植f2:3家系群体；青海大学试验基地，于2011年分别种植f2:3和f2:4家系群体。两亲本和分离群体的千粒重和角果长度表型在成熟期收获后经考种鉴定。考种数据表明：千粒重和角果长度在6个环境(2009武汉f2，2010武汉f2:3，2011武汉f2:3，2012武汉f2:3，2011西宁f2:3，2011西宁f2:4)下的均值均呈正态分布，表明千粒重和角果长度性状的数量遗传特征(图1)。
实施例2：
引物的开发和合成：
申请人利用的ssr引物是根据白菜和甘蓝scaffold序列开发的，分别命名为brsf和bosf系列，具体的开发方法是先利用ssrhunter软件在每个scaffold搜索ssr，然后用primer3.0软件设计ssr引物。自主开发的snp引物则是通过比对73290的重测序序列和中双11的参考基因组序列而来，首先，用bwa软件把73290的重测序序列定位到中双11的全基因组参考序列上，然后利用samtools软件查找snp。snp检测采用的是snap(singlenucleotideamplifiedpolymorphism)方法，即在引物设计时在snp位点处引入一个错配，在一个亲本中导致pcr扩增的失败。申请人已经通过生物公司合成了公共和新开发的ssr引物各3000多对，snp引物500来对。利用bwa软件把73290的重测序序列定位到中双11的参考基因组序列上，用samtools软件找出目标qtl区间的indel位点，然后用primer5.0软件设计indel引物，最后，利用亲本对新开发的引物进行多态性筛选，从中筛选多态性的共显性标记。
实施例3：
引物多态性的筛选，其流程如下：
(1)利用ctab法提取油菜叶片总dna，从亲本中各随机选择10株dna等量混合，作为筛选引物的模板。
(2)利用溶解后的引物对亲本dna进行pcr扩增，
反应体系：
pcr反应程序：
(3)凝胶电泳，带型判读。
实施例4：
f2群体基因型分析、遗传连锁图谱构建和qtl定位，其步骤如下：
(1)采用ctab法提取f2群体的dna；
(2)挑选出多态性引物对f2群体的dna进行pcr扩增，然后对pcr产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、显影、染色和带型判读。有差异的分子标记可分为两类：一类为共显性标记，即差异条带表现为位置上(既扩增产物大小)的变异，分离群体的带型依情况分别读作a、b和h，分别表示来源于中双11号、73290和杂合带型；另一类为显性标记，即差异条带表现为有无变异，读作a、c(在该位点上73290有带，分离群体中无带读a，有带读c)和b、d(在该位点上中双11号有带，分离群体中无带读b，有带读d)。
(3)通过对染色后获得的分子标记带型进行判读，获得分子标记基因型数据。
(4)利用joinmap3.0软件对f2群体的分子标记基因型数据进行连锁分析以构建分子标记遗传连锁图谱，获得19个连锁群(含803个分子标记)。
(5)基于该遗传图谱、f2群体的基因型数据以及f2:3和f2:4家系群体的千粒重和角果长度表型数据，利用qtlcart2.5软件进行qtl检测，在ssr标记brsf6-2562附近(表1)检测到了一个重复性很好的在所有6个环境中都能检测到的稳定表达主效qtl位点，其lod值和贡献率都较大(表2)，其对油菜千粒重的贡献率为23.7％，加性效应为-0.28，显性效应为0.09；对油菜角果长度的贡献率为30.2％，加性效应为-6.77，显性效应为0.64。
同时，申请人发现，本发明提供的标记brsf6-2562与申请人2016年的申请中涉及到的标记(申请号：2016105482828)，两个qtl位点之间存在极其显著的互作效应(表5,6)。其中，brsf6-2562标记的位点必须在brsf6-2389为73290背景下才有效应。两标记组合的表型数据分析如表3和表4所示。
brsf6-2389f:5’-tcaacttgacatgttcactaatagttt-3’,brsf6-2389r:5’-caatagacacggaaatgggc-3’。
表1千粒重和角果长度主效qtl连锁标记brsf6-2562的引物序列
表2千粒重和角果长度主效qtl的基本信息
表3两个主效qtl位点9种基因型组合的角果长度
表4两个主效qtl位点9种基因型组合的千粒重
表5千粒重在brsf6-2389和brsf6-2562两个标记的互作分析
表6角果长度在brsf6-2389和brsf6-2562两个标记的互作分析
实施例5：
分子标记brsf6-2562在油菜高产育种中的应用，其步骤是：
(1)田间种植brsf6-2389带型来源于73290的f2单株的后代种子。
(2)在定苗前对后代单株挂牌取样，并提取叶片总dna，利用分子标记brsf6-2562对其进行千粒重和角果长度主效qtl基因型的分析。
(3)连续多代自交后对获得的ril株系进行考种分析发现，brsf6-2562为73290背景的株系的千粒重和角果长度比背景为中双11的株系分别高0.64克和13.5毫米(表7)。可见分子标记brsf6-2562在甘蓝型油菜粒重和角果长度性状标记辅助选择中具有非常显著的效应，可以快速筛选出大粒长角果株系用于油菜高产育种。
表7ril株系考种数据
序列表
<110>中国农业科学院油料作物研究所
<120>甘蓝型油菜粒重和角果长度主效qtl位点的分子标记及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgtttcccctatatatttatttgtggt27
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tcaaaataacaacccattcca21
<210>3
<211>27
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcaacttgacatgttcactaatagttt27
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
caatagacacggaaatgggc20