一种含BODIPY杀菌材料及其制备方法和应用与流程

本发明属于抗菌材料领域，涉及一种含bodipy杀菌材料及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，由于抗生素的滥用导致了“超级细菌”的出现和传播。所谓“超级细菌”是指这些细菌对于目前的抗生素具有多重耐药的特性，这对于临床创伤感染的治疗增添了很大的难度。因此发展新的抗感染策略迫在眉睫。光动力抗菌治疗方法，就是其中最具前景的新疗法之一，对于细菌、真菌和病毒引起的感染，特别是对于耐药菌感染显示很好的疗效。

光动力疗法是利用光和光敏剂产生的光动力效应进行疾病诊断和治疗的一种技术。光动力抗菌的作用机制复杂，其基本原理是选择合适波长的光激发光敏剂从低能量的基态跃迁至高能量的三线态，并与目标微生物的生物分子反应，产生自由电子和(或)自由基，生成单态氧，然后单态氧再对目标微生物产生毒性，从而达到灭活微生物的目的。

bodipy(氟硼二吡咯)作为卟啉类荧光染料近亲家族，具有很好的光动力治疗效果。此外，bodipy的优点有：良好的光热稳定性、吸收和发射峰窄、摩尔吸光系数和量子产率高、对ph不敏感等。但bodipy化合物的水溶性较差，这大大的限制了这类化合物的应用，需要通过进一步的化学修饰来满足实际应用的需要。溶解或分散较好的bodipy衍生物比疏水性或团聚的bodipy衍生物能更有效地杀死细菌。

综上所述，开发出一种具有良好水溶性bodipy抗菌剂的方法是很有必要的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于克服bodipy不溶于水的缺点，提供一种含bodipy杀菌材料及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明具体提供了如下的技术方案：

1、一种含bodipy杀菌材料，结构式为：

进一步，进一步，所述材料可通过光活化产生活性氧自由基。

2、一种含bodipy杀菌材料的制备方法，包括以下步骤：

1)bodipy-n3的制备：将bodipy-br与叠氮化钠进行反应，制得bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3与炔化的麦芽七糖在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行反应，制得bodipy-mal；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal与碘酸和碘发生碘代化反应，制得bodipy-mal-i抗菌材料；

所述bodipy-br的结构式为：

所述bodipy-n3的结构式为：

所述炔化的麦芽七糖的结构式为：

所述bodipy-mal的结构式为：

进一步，所述步骤1)中，bodipy-br与叠氮化钠摩尔比为1:1～1:2，反应温度为40～70℃。

进一步，所述步骤2)中，bodipy-n3与炔化的麦芽七糖的摩尔比为0.8:1～1.2:1，反应温度为40～70℃。

进一步，所述步骤3)中，按摩尔数计，bodipy-mal:碘酸:碘＝1:1.5:1.5～1:2.5:2.5，反应温度为40～70℃。

进一步，所述步骤1)和步骤2)反应的溶剂为dmf；步骤3)反应的溶剂为水。

进一步，步骤1)反应产物用乙酸乙酯萃取，饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥；步骤2)和3)的反应产物用水透析后过滤冻干，透析的截留分子量为500d。

3、如权利要求1所述的一种含bodipy杀菌材料在抗革兰氏阳性菌上的应用。

本发明的有益效果在于：本发明制备得到的bodipy-mal-i杀菌材料不仅具有很好的水溶性，还完整保留了bodipy的性质，bodipy-mal-i产生的光动力可以有效地灭活酵母细胞，尤其对革兰氏阳性菌起到杀菌作用。该制备方法具有反应步骤简单，反应条件温和，危险性小，低毒等优点。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为制备bodipy-mal-i杀菌材料的反应示意图。

图2为bodipy-mal-i抗菌材料的紫外吸收光谱。

图3为bodipy-mal-i抗菌材料荧光谱图。

图4为bodipy-mal-i抗菌材料的光漂白实验图。

图5为sa,se,ec,pa的生长曲线。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明的bodipy-mal-i杀菌材料通过如图1所示的反应制得，将bodipy-br与叠氮化钠进行反应，制得bodipy-n3；将bodipy-n3与炔化的麦芽七糖在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行反应，制得bodipy-mal；将bodipy-mal与碘酸和碘发生碘代化反应，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

实施例1

bodipy-mal-i多功能杀菌材料1的制备：

1)bodipy-n3的制备：称取350mgbodipy-br，用8mldmf溶解，与叠氮化钠在70℃下反应12h，摩尔比为1:1，然后，待产物降至室温，加入乙酸乙酯萃取，用饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压旋干得到bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3用dmf溶解，同时加入炔化的麦芽七糖(mal7-alkyne)，无氧条件下，在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行“点击反应”，温度为40℃下反应24h，摩尔比bodipy-n3:mal7-alkyne＝1:0.8，反应结束后，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal用水溶解，加入碘酸(hio3)和碘(i2)使其碘代化，温度为70℃下反应2h，摩尔比bodipy-mal:hio3:i2＝1:1.5:1.5，反应结束降至室温，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

实施例2

bodipy-mal-i多功能杀菌材料2的制备：

1)bodipy-n3的制备：称取380mgbodipy-br，用10mldmf溶解，与叠氮化钠在60℃下反应24h，摩尔比为1:1.5，然后，待产物降至室温，加入乙酸乙酯萃取，用饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压旋干得到bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3用dmf溶解，同时加入炔化的麦芽七糖(mal7-alkyne)，无氧条件下，在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行“点击反应”，温度为50℃下反应24h，摩尔比bodipy-n3:mal7-alkyne＝1:1，反应结束后，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal用水溶解，加入碘酸(hio3)和碘(i2)使其碘代化，温度为60℃下反应2h，摩尔比bodipy-mal:hio3:i2＝1:2:1.5，反应结束降至室温，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

实施例3

bodipy-mal-i多功能杀菌材料3的制备：

1)bodipy-n3的制备：称取400mgbodipy-br，用10mldmf溶解，与叠氮化钠在50℃下反应36h，摩尔比为1:2，然后，待产物降至室温，加入乙酸乙酯萃取，用饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压旋干得到bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3用dmf溶解，同时加入炔化的麦芽七糖(mal7-alkyne)，无氧条件下，在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行“点击反应”，温度为60℃下反应24h，摩尔比bodipy-n3:mal7-alkyne＝0.8:1，反应结束后，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal用水溶解，加入碘酸(hio3)和碘(i2)使其碘代化，温度为50℃下反应2h，摩尔比bodipy-mal:hio3:i2＝1:2:2，反应结束降至室温，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

实施例4

bodipy-mal-i多功能杀菌材料4的制备：

1)bodipy-n3的制备：称取350mgbodipy-br，用10mldmf溶解，与叠氮化钠在40℃下反应36h，摩尔比为1:2，然后，待产物降至室温，加入乙酸乙酯萃取，用饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压旋干得到bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3用dmf溶解，同时加入炔化的麦芽七糖(mal7-alkyne)，无氧条件下，在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行“点击反应”，温度为70℃下反应24h，摩尔比bodipy-n3:mal7-alkyne＝1:1，反应结束后，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal用水溶解，加入碘酸(hio3)和碘(i2)使其碘代化，温度为40℃下反应2h，摩尔比bodipy-mal:hio3:i2＝1:2:2.5，反应结束降至室温，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

实施例5

bodipy-mal-i多功能杀菌材料5的制备：

1)bodipy-n3的制备：称取400mgbodipy-br，用10mldmf溶解，与叠氮化钠在50℃下反应24h，摩尔比为1:1.5，然后，待产物降至室温，加入乙酸乙酯萃取，用饱和氯化铵洗涤，无水硫酸钠干燥，经减压旋干得到bodipy-n3；

2)bodipy-mal的制备：将步骤1)中bodipy-n3用dmf溶解，同时加入炔化的麦芽七糖(mal7-alkyne)，无氧条件下，在cucl/pmdeta络合物的催化作用下进行“点击反应”，温度为60℃下反应36h，摩尔比bodipy-n3:mal7-alkyne＝1:1.2，反应结束后，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干；

3)bodipy-mal-i的制备：将步骤2)中bodipy-mal用水溶解，加入碘酸(hio3)和碘(i2)使其碘代化，温度为60℃下反应2h，摩尔比bodipy-mal:hio3:i2＝1:2.5:2.5，反应结束降至室温，将产物放入500d透析袋用去离子水透析，并用0.22μm的针孔过滤器过滤后冻干，制得bodipy-mal-i抗菌材料。

bodipy-mal-i抗菌材料的结构表征如图2、3、4所示。

图2是bodipy-mal-i抗菌材料水溶液(c＝0.025mg/ml)的紫外吸收光谱，从图中可以看出，340-600nm范围内均出现了紫外吸收峰。

图3是bodipy-mal-i抗菌材料水溶液(c＝0.1mg/ml)的荧光谱图，从图中可以看出，在激发波长为490nm时，bodipy-mal-i抗菌材料能发射出强烈的荧光。

图4是bodipy-mal-i抗菌材料的光漂白实验图，图中表示在可见光照射下(400-780nm，60mw)，在379nm处指示剂ada的紫外吸收值随光照时间的增加呈现出明显的下降幅度。说明了光照后的bodipy-mal-i抗菌材料会产生ros，所产生ros作用于显色指示剂。bodipy-mal-i杀菌材料通过光活化产生活性氧自由基使得菌体细胞膜的通透性发生了改变，进而破坏菌体正常生理代谢，导致菌体的死亡，进一步证明了所制备的bodipy-mal-i材料具有杀菌作用。

实施例6

利用bodipy-mal-i杀菌材料进行杀菌效果检测，具体内容如下：

1.细菌的培养：从-20℃冰箱中取出装有菌株的冻存管，使之融化，然后接种于胰蛋白胨大豆肉汤(tryptonesoyabroth,tsb)培养基中，并在37℃摇床培养，备用。一般提前一天培养。

2.细菌生长曲线：细菌生长曲线是将少量的单细胞微生物接种到一定容积的液体培养基后，在适宜的条件下培养，定时测定细胞数量。以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标，可得出一条生长曲线，曲线显示了细菌生长繁殖的四个时期：迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期。具体步骤为(下述所用器材及液体均事先灭菌)：

(1)先将菌株用磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,pbs)稀释到1×10⁵；

(2)取4ml的离心管并标记，在离心管加入400μl细菌溶液和800μlbodipy-mal-i杀菌材料水溶液，混合均匀；

(3)取其中一半混合溶液用波长为400-780nm，光照强度60mw的可见光照射10min，放入37℃细菌烘箱里培养2h；

(4)另取4ml的离心管并标记好，各加入2mltsb，将上述培养2h后的细菌溶液各取100μl加入到对应编号离心管中(如：1号→1号)，混合均匀；

(5)将(4)中离心管的细菌溶液用移液枪加入到96孔板中，一个样一列，一个孔100μl；

(6)用pbs替代样品溶液，做空白对照实验，操作一致。

最后放入37℃细菌烘箱里培养，间隔2h测其od值，直至细菌生长进入衰亡期；以时间为横坐标，以活菌数(od)的对数为纵坐标，做细菌生长曲线。

图5为sa,se,ec,pa的生长曲线：(a)sa在光照与不光照条件下的生长曲线；(b)se在光照与不光照条件下的生长曲线；(c)ec在光照与不光照条件下的生长曲线；(d)pa在光照与不光照条件下的生长曲线。从图中可以看出，相比于空白组，在光照条件下，bodipy-mal-i杀菌材料对sa和se显示出了很强的杀菌效果，而bodipy-mal-i杀菌材料对ec和pa没有明显的杀菌作用。

杀菌测试表明：bodipy-mal-i杀菌材料对以金黄色葡萄球菌(s.aureus)和表皮葡萄球菌(s.epidermidis)为代表的革兰氏阳性菌有明显的杀菌作用，对以大肠杆菌(e.coli)和绿脓杆菌(p.aeruginosa)为代表的革兰氏阴性菌没有杀菌作用。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。