本发明涉及烟叶中有效成分综合利用的方法，可同时制备烟碱、茄尼醇、香料、芦丁、绿原酸和微生物菌肥；属于生物工程领域。
背景技术：
我国的烟草种植面积和产量均在世界前列，但由于受种植管理技术和加工技术的限制，在栽培、运输及制作卷烟过程中约25％的烟叶、下脚料不被充分利用而遭废弃。将这些废弃烟叶焚烧或是随意丢弃，不仅浪费，而且污染环境。经研究，烟叶中已经鉴定出300多种化合物，其中烟碱、茄尼醇、香料、芦丁和绿原酸等重要化合物是烟叶中的主要成分，在化工、医药、农业等方面有着广泛应用。
烟草中含有丰富的烟草香味物质，这些香味成分多是弱极性物质，其中新植二烯是烟草中的非色素类萜烯，在烟草挥发性香味物质中含量最高，是烟叶中重要的致香物质之一，在烟叶中含量为0.05-0.2％之间。另外巨豆三烯酮、寸拜醇、棕榈酸和棕榈酸乙酯等对致香也有重要作用。废弃烟叶回收香料成分，目前主要添加在卷烟中，使其达到降低烟碱含量同时，不影响其香气风格的作用。
茄尼醇是一种四倍半萜醇，无旋光活性，占烟叶干重的0.5-4.0％，以游离态和化合态存在于烟叶中，化合态以脂肪酸酯的形式存在。茄尼醇具有抗菌消炎和抗癌生物活性，对充血性心脏病治疗过程中的肺充血、浮肿、心绞痛具有良好的治疗作用、并对亚急性肝坏死、急慢性肝炎、十二指肠溃疡、治疗坏血病、坏死性牙周炎、胃溃疡凝血等疾病具有良好医疗效果。茄尼醇还可用于合成具有生物活性的泛醌类物质，例如辅酶Q10和维生素K2。
绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物，是烟叶中含量最高的多酚类物质，约占烟叶干重的0.5-2％，主要包括绿原酸及其衍生物隐绿原酸、新绿原酸和咖啡酸等。绿原酸是一种重要的生理活性物质，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、降糖利胆、增高白血球等多种药理作用，在保健品、药品及化妆品等领域有广泛应用。
烟碱属于二元有机弱碱。烟叶中烟碱的含量约占总生物碱的95％，在烟叶中含量一般为1-6％，是制作绿色农药的重要原料，可用于制取高效绿色杀虫剂，具有低毒高效、残效期长、对作物安全、无药害、杀虫谱广、内吸和渗透较强等优点。
芦丁又名芸香苷、紫槲皮苷，是一种来源很广的黄酮类化合物，在烟叶中含量约为0.5～1.5％(湖南大学学报(自然科学版)2005,31,616-619)。芦丁具有广泛的生物活性，主要包括抗自由基活性、抗脂质过氧化物作用、维生素P样作用、抗炎作用、对心血管的保护作用、一直血小板活化作用等，用途十分广泛。
因为香料和烟碱、茄尼醇、芦丁以及绿原酸的含量和化学性质相差较大，提取方法也有较大差别，香料成分的提取方法主要包括水蒸气蒸馏法、溶剂提取法和超临界二氧化碳提取法，水蒸气蒸馏方法提取香料的得率较高，同时因烟碱也有一定的挥发性，烟叶中部分烟碱也能被提取，但因该条件不利于植物细胞破壁和烟碱的释放，香料成分的收率也较低，提取得到香料成分中烟碱含量偏高，同时提取时需要使用水蒸气，也存在提取过程能耗高的缺点。采用弱极性溶剂也可以提取香料成分，使用的溶剂包括石油醚、正己烷、乙酸乙酯等，提取得到的香料纯度较好，但收率较低，烟碱残留量高。二氧化碳超临界萃取法的成本高、设备投入大，也制约了其在生产实践中的应用。CN 101940361B公开了一种在废弃烟叶中添加复合植物水解酶、纤维素酶和中性蛋白酶提取香料成分的方法，能够提高指标成分新植二烯的含量，但添加的酶成本高，工艺复杂，而且获得的浸膏中新植二烯的含量只有1.366-1.799μg/g,即新植二烯的含量只有0.0001％-0.0002％，同时该方法也不能够综合利用烟碱、茄尼醇、芦丁和绿原酸等有效成分。
现有技术中，烟碱的提取主要是水提法，然后通过蒸馏法、离子交换法、有机溶剂或超临界二氧化碳萃取进行纯化。茄尼醇的提取，一般选用弱极性有机溶剂，如正己烷、石油醚等；绿原酸提取则酸性醇溶液进行提取，芦丁主要采用水或醇提取。由此可知，同时提取这几种有效成分并不容易，烟碱和茄尼醇共提取的有一些报道，提取方法主要包括使用硫酸水和丙酮两步法，烟碱和茄尼醇的收率分别为80.2％和83.4％(福州大学学报，2008，36，308-312)和正己烷和4％氢氧化钠/正己烷两步法，烟碱和茄尼醇的收率分别为75％和70％(中国医药工业杂志2006，37，458-459)等，但并不能综合利用芦丁、绿原酸和香料。CN104151140B和CN104326912B分别利用酸性乙醇溶液超声辅助以及石油醚/磷酸水两相体系可以同时提取绿原酸、茄尼醇和烟碱，但这些方法均不能综合利用香料和芦丁成分。而且收率也不令人满意，例如，CN104151140B专利中，茄尼醇、烟碱和绿原酸的浸膏提取收率分别只有48.2％，59.4％和62.7％，加上后续精制的步骤，收率将更低。CN104326912B获得的绿原酸的纯度不高于47％，收率不高于46％，同时过程中必须使用超声辅助，设备成本高，放大困难。烟碱纯化中，必须使用水蒸气蒸馏结合二氯甲烷萃取的方法，水蒸气蒸馏法的能耗高、二氯甲烷的毒性大，这些因素限制了其在工业实践中应用。CN106496034A公开了一种同时从烟叶种分离绿原酸和芦丁的方法，用水溶解、50℃搅拌提取，使用大孔树脂进行绿原酸和芦丁的纯化，得到了纯度较高的绿原酸和芦丁，但收率分别只有60％和56.2％，同时该方法也不能综合利用烟碱、香料和茄尼醇。CN1093540C公开了一种从烟叶中同时提取烟碱和芦丁的方法，采用水提、有机溶剂萃取的方法得到烟碱，并经过大孔树脂进行烟碱和芦丁的纯化，但因为未测定原料中烟碱和芦丁的含量，收率未知，而且对于烟碱和芦丁来讲，采用大孔树脂法进行纯化，增加了工艺步骤，也会影响其收率。李晓芹等公开了一种从烟叶中同时提取茄尼醇、绿原酸、芦丁和烟碱的方法，采用超声波辅助提取的方法，获得有效成分的提取液，再采用冷却沉淀得方法分离茄尼醇，再采用分步萃取和精制的方法获得其他3种有效成分(烟草主要功能成分的联合提取及抗氧化活性研究，中国农业科学院学位论文2015)，该方法的茄尼醇的得率较高，但因为芦丁在低温水溶液中溶解度较差，会随着茄尼醇一起析出，影响了芦丁得收率。同时，过滤或离心去除沉淀得上清液，直接萃取绿原酸时，因为芦丁在乙酸乙酯中有溶解性，而被提取，影响了绿原酸的纯度和芦丁的收率。同时因为茄尼醇分离时，未经过弱极性溶剂萃取，残留着较多的杂质，使得烟碱粗品的纯度也偏低，如采用更复杂得方法除去绿原酸、烟碱中的这些杂质，则会降低两种有效成分得收率。此外使用该方法也无法实现香料成份的综合利用。虽然由此可知，现有的技术尚无法在获得高纯度的烟碱、茄尼醇、香料、芦丁和绿原酸同时，且保证各种有效成份均具有较高的收率。
另一方面，废弃烟叶中含有大量多糖类成分、如淀粉、纤维素、木质素等，以及有机酸和蛋白质，即使提取有效成分的残渣，质量也还能占废弃烟叶的50％以上，如作为废料被遗弃，将给地源环境造成不良影响。人们也尝试开展了废弃烟叶或废弃烟叶提取后残渣的高值化利用，如利用提取烟碱的残渣制备活性炭(煤炭转化，2004，27，64-66)，但活性炭附加值比较低，无法做到残渣的高值化利用。也有科技工作者将废弃烟叶或者提取过有效成分的残渣进行微生物菌肥的制备，但因为烟叶中烟碱对很多微生物有抑制作用，如果作为微生物菌肥基质的烟叶或者残渣中，烟碱含量过高，则会产生微生物菌肥制备周期长、活菌数低。如CN103274784A公开了一种田间处理废弃烟叶生产有机肥方法，将废弃烟叶粉碎后，加入小麦秸秆、尿素、马粪等，自然发酵制备有机肥料，但因为烟碱成分未经过去除，堆肥的时间需要21-90天，效率较低。
综合分析现有的技术我们发现，现有技术存在的主要缺陷在于：1)有效成分利用不充分，无法实现废弃烟叶的烟碱、茄尼醇、香料、芦丁、绿原酸和菌肥的联产；2)有效成分提取工艺路线繁琐、能耗高、放大困难、环境不友好、收率和纯度低；3)制备微生物菌肥周期长、活菌数低。所以生产实践中急需高收率、低成本从废弃烟叶原料中同时制备烟碱、茄尼醇、香料、芦丁、绿原酸和微生物菌肥的方法，该方法制备的香料的收率和纯度均应较高，以提高香料成分综合利用的效率和附加值，同时香料中的烟碱含量也应当较低，以利于其在低烟碱、低焦油含量的卷烟中应用，而且烟碱、茄尼醇、香料、芦丁和绿原酸的含量也应较高，微生物菌肥生产周期短、活菌数高，以利于其高值化应用。另外现有技术有效成分利用不充分，废液中残留的成份影响微生物生长，只能环保处理后才能排放，也增加了生产成本。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种使用废弃烟叶同时制备高纯度烟碱、茄尼醇、香料、芦丁、绿原酸以及微生物菌肥的方法，以解决现有方法有效成分利用不充分，工艺复杂、收率低，香料浸膏中烟碱的含量高，烟碱、茄尼醇、香料、芦丁和绿原酸纯度低等问题。
为此，本发明提供一种废弃烟叶综合利用的方法，包括如下步骤：
(1)提取：将干燥、粉碎后的烟叶与溶液I热回流，热回流温度为35-80℃，时间为10min～6小时/次，重复1-5次，料液质量比为1:3～50，得提取液以及烟叶残渣；所述的溶液I是70％-95％(v％)的乙醇水溶液；
(2)香料浸膏和茄尼醇的制备：去除提取液中的乙醇，调pH为1-6，以石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯或煤油进行萃取，萃取次数为1-6次，得到萃取液I和萃余液I；萃取液I经浓缩、脱水、蒸馏、干燥后得到香料浸膏粗品；将香料浸膏粗品溶于70％-90％(v％)的乙醇、甲醇、丙酮或乙腈的水溶液，以大孔树脂层析，并使用80％-100％(v％)的乙醇、甲醇、丙酮或乙腈的水溶液洗脱，流穿组份合并浓缩至干，得到香料浸膏精品，洗脱组分合并浓缩至干，溶于乙醇、甲醇、丙酮或乙腈，10至-20℃结晶，得到茄尼醇；
(3)芦丁制备：将萃余液I浓缩为原体积的25％-80％后静置过夜，析出沉淀，离心或过滤法收集沉淀；并以70-95℃热水或50-75℃热乙醇重结晶，料液质量比为1:10-100，得到芦丁；
(4)绿原酸制备：步骤(3)中回收沉淀后的残液，以乙酸乙酯萃取，pH为1-6，萃取次数为1-6次，得萃取液II和萃余液II，萃取液II浓缩至干后得到绿原酸浸膏，将浸膏溶于水，调节pH值为1-6，以大孔树脂层析，使用5％-70％的乙醇、丙酮、甲醇或乙腈的水溶液洗脱，洗脱液浓缩后，使用乙酸乙酯萃取，浓缩至干，使用水饱和乙酸乙酯或乙醇结晶，得到绿原酸；
(5)烟碱制备：将萃余液II调pH为8-14，加入等体积的石油醚、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯或煤油萃取，萃取次数为1-6次，得到萃取液III和萃余液III，将萃取液III浓缩、脱水、蒸馏、干燥后即得到烟碱纯品。
本发明的有益效果：提供了一种烟叶中有效成分综合利用的技术，通过提取、溶剂萃取、柱层析和结晶等方法，实现了有效成分的高效分离，并制备高纯度的烟碱、绿原酸、茄尼醇以及不含烟碱的香料浸膏精品、利用提取有效成分后的残渣发酵生产微生物菌剂。本发明提供的技术，工艺简捷，成本低，过程中不使用水蒸气蒸馏等高能耗的方法，符合规模化工业生产要求。有效成分的收率和纯度高，提取有效成分后的废液可用于微生物菌肥的培养，制备的菌肥生产周期短、活菌数高，是一种经济性好、高效、对环境友好的烟叶有效成分综合利用的技术。
具体实施方式
本发明提供了一种烟叶的综合利用方案，在本发明所述的烟叶综合利用的技术方案中，可以对各参数进行优化，以获得本发明较为优选的具体实施方式。
具体实施方式之一，所述步骤(1)中热回流温度为45-70℃；溶液I是80-95％的乙醇水溶液。
另一具体实施方式中，所述的步骤(2)中去除提取液中的乙醇后，调pH1-4。
另一具体实施方式中，所述的步骤(3)中将萃余液I浓缩为原体积的25％-50％。
再一具体实施方式中，所述的步骤(4)乙酸乙酯萃取的pH值为1-4；进行大孔树脂层析时，将浸膏溶于水调pH 1-4。
另一具体实施方式中，所述的步骤(5)中pH值为8-12。
显然，上述具体的实施方式中所述及的用于获得更加优异技术效果的技术特征可以任意组合，以在更大程度上优化所获得的技术效果。此处作为距离提供优化的技术方案之一：上述本发明的方法中，所述的步骤(1)中热回流温度为45-70℃；溶液I是80-95％的乙醇水溶液；所述的步骤(2)中去除提取液中的乙醇后，调pH1-4；
所述的步骤(3)中将萃余液I浓缩为原体积的25％-50％；所述的步骤(4)乙酸乙酯萃取的pH值为1-4；进行大孔树脂层析时，将浸膏溶于水调pH 1-4；所述的步骤(5)中pH值为8-12。
本发明的技术方案中，步骤(2)和步骤(4)所使用的大孔树脂均是非极性或弱极性大孔树脂，在两个步骤中可分别独立地选择XDA-1,801,806，XR919C，HPD600，AB-8或HZ802。
更为优选的实施方式中，本发明所述的废弃烟叶综合利用的方法包括如下步骤：
(1)提取：将干燥、粉碎后的烟叶与90％(v％)的乙醇水溶液按照料液质量比1：10混合，50℃热回流提取30min，得提取液和残渣；
(2)香料浸膏和茄尼醇的制备：香料浸膏和茄尼醇的制备：去除提取液中的乙醇，调pH为3，以石油醚进行萃取，萃取次数为3次，得到萃取液I和萃余液I；萃取液I经浓缩、脱水、蒸馏、干燥后得到香料浸膏粗品；将香料浸膏粗品溶于90％的乙醇水溶液，以大孔树脂层析，并使用100％的乙醇溶液洗脱，流穿组份合并浓缩至干，得到香料浸膏精品，洗脱组分合并浓缩至干，溶于乙醇、甲醇、丙酮或乙腈，4℃结晶，得到茄尼醇；
(3)芦丁制备：将萃余液I浓缩为原体积的50％后静置过夜，析出沉淀，离心或过滤法收集沉淀；并以85℃热水重结晶，料液质量比为1:20，得到芦丁；
(4)绿原酸制备：步骤(3)中回收沉淀后的残液，以乙酸乙酯萃取，pH为3，萃取次数为5次，得萃取液II和萃余液II，萃取液II浓缩至干后得到绿原酸浸膏，将浸膏溶于水，调节pH值为3，以大孔树脂层析，使用35％的乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩后，使用乙酸乙酯萃取，浓缩至干，使用乙醇结晶，得到绿原酸；
(5)烟碱制备：将萃余液II调pH为10，加入等体积的石油醚萃取，萃取次数为3次，得到萃取液III和萃余液III，将萃取液III浓缩、脱水、蒸馏、干燥后即得到烟碱纯品。
基于本发明所述的技术方案及其优选的具体实施方式，本发明所制备得到的香料浸膏中，以索式提取法为参照，香料中新植二烯的收率大于75％，新植二烯的含量大于7％，不含烟碱；纯化后的烟碱、茄尼醇、芦丁和绿原酸的质量纯度大于90％，绿原酸的质量纯度大于65％，烟碱的收率大于70％，茄尼醇的收率大于55％，芦丁的收率大于68％，绿原酸的收率大于65％。
进一步地，本发明中还包括对步骤(1)提取后的残渣进行综合利用的方案，具体地，在上述方法基础上，还包括以步骤(1)的残渣为原料接种微生物菌种进行固态培养的步骤，所述的微生物菌种选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)或其混合物。
作为优选，所述的微生物菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)的混合菌种；其中，根据活菌数计算，胶质芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、淡紫拟青霉菌的比例是1～10∶1～10∶1。
更为具体地，所述的固态发酵包括如下步骤：
(a)将枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和淡紫拟青霉菌分别按照接1-15％的接种量接种于种子培养基中，30～37℃、150～200rpm摇床培养至OD620为4～6，获得三种菌种的种子培养液，按照比例混合得混合菌种；
胶质芽孢杆菌的种子培养基为含0.2～1g/100ml磷酸铵的糖蜜5～50倍稀释液；
枯草芽孢杆菌种子培养基为糖蜜5～50倍稀释液；
淡紫拟青霉菌种子培养基为糖蜜5～50倍稀释液；
(b)将烟叶残渣与水按质量比1:1.2-2.0的混合物作为发酵原料，按发酵原料总质量接种1～15％的混合菌种，10-37℃条件下，发酵7-14天，每隔24～48h翻料一次；
通过上述的方案的整合，一方面高效优质地获得多个活性组分，另一方面，利用提取后的烟叶废渣制备得到优质的微生物菌肥，其中活菌数大于8×108/g。
再一方面的综合方案中，更包含体系中的溶剂循环利用以实现高标准的节能减排目标，所述的步骤(1)的残渣去除溶剂后作为微生物发酵的原料，该溶剂回收用于步骤(1)的提取；所述步骤(2)中从萃取液中回收的溶剂用于步骤(2)和步骤(5)的萃取；所述步骤(3)中回收的溶剂用于步骤(3)的萃取。进一步，所述烟叶残渣为原料进行发酵的过程中，所述发酵原料中的水可以部分使用萃余液III代替，优选使萃余液III与水的质量比为0.1:10～7:3。
下面结合非限制性实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
如无特别说明，本说明书中，述及液体与液体的混合溶液浓度时，均指体积浓度。m％表示质量百分比。v％表示体积百分比。
本发明中使用的烟叶为云南产废弃烟叶，将烟叶干燥后粉碎，过20目筛后备用。提取用溶剂均为分析纯试剂，其中石油醚沸程为30-60℃,HPLC分析中的甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯溶剂。烟碱、茄尼醇、绿原酸、芦丁和新植二烯标准品分别购自上海羽朵生物科技有限公司和大连美仑生物有限公司，纯度均大于95％，大孔树脂均购自华东理工大学上海华震科技有限公司，枯草芽孢杆菌菌种、胶质芽孢杆菌和淡紫拟青霉菌为本课题组筛选获得。
本发明中，烟碱、茄尼醇和绿原酸的定量分析方法：均采用HPLC法进行分析，色谱柱：Agilent 5HC-C18(2)150×4.6mm；烟碱的HPLC条件为：流速均为1mg/ml，流动相：甲醇-磷酸盐缓冲液(1:9)，磷酸盐缓冲溶液为0.02mol/L Na2HPO4，0.01mol/L三乙胺，用磷酸调节pH为6.5；检测波长：260nm。茄尼醇HPLC条件为：流速均为1mg/ml，流动相：甲醇与乙醇(3：2)。检测波长：210nm；绿原酸的HPLC条件为：0.1％甲酸水溶液：乙腈(7：3)。检测波长：323nm。芦丁的HPLC条件为：0.2％乙酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，洗脱条件为0-10min,15％-30％B,检测波长为254nm。将烟碱、茄尼醇、绿原酸和芦丁的标准品稀释为不同浓度，进行标准曲线的测定。使用得到的标准曲线进行样品含量分析。
新植二烯定量分析方法：采用GC法进行分析，色谱条件为：HP-5MS柱(30m×0.25mm,粒径0.25μm)，载气为N2，柱前压400KPa，空气柱前压50KPa，氢气柱前压60KPa，进样口温度280℃，检测器温度280℃；进样量1.0μl；升温程序为：初始温度50℃，保持2min，以6℃/min的升温速率升至280℃，保持10min。将新植二烯标准品稀释为不同浓度，进行标准曲线的测定，进行样品含量分析。
利用柱层析进行茄尼醇和绿原酸的纯化时，可以使用薄板层析(TLC)法检测有效成分的洗脱情况，其中茄尼醇的展层条件为石油醚：乙酸乙酯＝9:1，绿原酸的展层条件为；乙酸丁酯:甲醇:甲酸＝8:1.5:1.5，均采用5％的磷钼酸乙醇溶液作为显色剂。
收率的计算方法为：
各步收率(％)＝[本步操作前有效成分总质量(mg)/本步操作后有效成分总质量(mg)]×100％
总收率(％)＝终产品种有效成份总质量/(实施例1测得的有效成分含量*原料质量)*100％。
实施例1.烟叶中烟碱、茄尼醇、绿原酸和香料成分的含量测定
称取10g烟叶样品，进行索式提取，提取溶剂为70ml 90％乙醇，提取温度70℃，提取时间为4小时。平行进行三次实验，测得的烟碱含量均值为31.5mg/g烟叶，绿原酸的含量为6.66mg/g烟叶，新植二烯含量为1.46mg/g烟叶，芦丁含量为5.0mg/g烟叶，将索式提取液加入NaOH至终浓度为0.3M 70℃皂化30min，测得皂化液中茄尼醇的含量为9.1mg/g烟叶，烟碱、绿原酸、茄尼醇、芦丁和新植二烯含量分别为3.15％，0.66％，0.91％，0.50％和0.15％。
实施例2.香料粗浸膏的制备1
称取60g烟叶样品置于1L圆底三口烧瓶中，加入600mL 90％的乙醇水溶液，50℃热回流30分钟，共提取3次，合并得回流液以及残渣。GC和HPLC分析表明在回流液中，烟碱、茄尼醇、绿原酸、绿原酸、新植二烯和芦丁的提取收率分别为87.5％，61.9％，95.9％，93.5％，91.1％和92％。回流液在水浴温度35℃下，用真空旋转蒸发仪来蒸掉乙醇，用稀硫酸调至pH 2，用等体积石油醚萃取3次，得到石油醚萃取液和萃余液I，合并石油醚萃取液后，35℃水浴下减压浓缩、干燥，即得香料浸膏。GC和HPLC分析表明，香料浸膏中新植二烯的质量纯度为3.2％，总收率为91.9％，茄尼醇的质量纯度为16.2％，烟碱的质量纯度为0.2％，绿原酸的质量纯度为0％，芦丁的质量纯度为0％。
实施例3.香料粗浸膏的制备2
称取60g烟叶样品置于1L圆底三口烧瓶中，加入600mL 80％的丙酮水溶液，50℃热回流30分钟，共提取3次，合并得回流液以及残渣。GC和HPLC分析表明在回流液中，烟碱、茄尼醇、绿原酸、绿原酸、新植二烯和芦丁的提取收率分别为90.0％,51.0％,96.0％，88.0％和91％。回流液在水浴温度35℃下，用真空旋转蒸发仪来蒸掉丙酮，用稀硫酸调至pH 3，用等体积正己烷萃取3次，得到正己烷萃取液和萃余液I，合并正己烷萃取液后，30℃水浴下减压浓缩、干燥，即得香料提取物。GC和HPLC分析表明，香料浸膏中新植二烯的质量纯度为2.8％，总收率为88.9％，茄尼醇的质量纯度为16.0％，烟碱的质量纯度为0.3％，绿原酸的质量纯度为0％，芦丁的质量纯度为0％。
实施例4.芦丁的制备
将实施例2提取香料后的萃余液I，浓缩3倍，室温静置10h,有深黄色沉淀析出，过滤后得到的深黄色沉淀和滤液，芦丁沉淀收率为85％，按照1:20(w/w)加入热水溶解进行重结晶，过滤除去不溶物，至于室温环境24h，析晶，得到淡黄色晶体，过滤、干燥后，得到芦丁，质量纯度98.0％，总收率71％。
实施例5.绿原酸浸膏的制备
将实施例4中芦丁沉淀的滤液，使用乙酸乙酯萃取，提取次数为5次，得到乙酸乙酯萃取液和萃余液II，乙酸乙酯萃取液脱水，蒸干，可得绿原酸浸膏，收率95％，绿原酸的质量纯度13％，不含烟碱、茄尼醇、新植二烯、芦丁等有效成分。
实施例6.烟碱的制备1
将实施例5中的绿原酸提取后的萃余液II，用氢氧化钠调pH 10，用等体积石油醚萃取3次，得到石油醚萃取液和萃余液III，合并石油醚萃取液，45℃水浴下减压浓缩，干燥后，得到烟碱，HPLC分析表明，烟碱的质量纯度为99.0％，总收率为79.9％，不含新植二烯、茄尼醇、绿原酸和芦丁。
实施例7.烟碱的制备2
将实施例5中的绿原酸提取后的萃余液II用氢氧化钠调pH 12，用等体积氯仿萃取3次，得到氯仿萃取液和萃余液III，合并氯仿萃取液，35℃水浴下减压浓缩，干燥后，得到烟碱，GC和HPLC分析表明，烟碱的质量纯度为99.2％，总收率为79.5％，不含茄尼醇、绿原酸、新植二烯和芦丁。
实施例8.茄尼醇的制备1
将实施例2制备的香料浸膏，按照体积比1:50的比例溶于90％乙醇中，加入0.3M的NaOH溶液，混匀，70℃皂化30min，将pH调到2，过滤，用石油醚萃取三次，得到澄清溶液，将石油醚蒸干，得到皂化浸膏，皂化后，茄尼醇皂化收率为158％，提取和皂化得到的茄尼醇为97.9％。将该浸膏以20mg/ml的浓度溶于90％乙醇中，上样大孔树脂AB-8，洗脱条件为100％乙醇10BV。用TLC或者HPLC法检测各馏分的茄尼醇，收集洗脱液，合并后进行浓缩至干，即得到茄尼醇的纯化物。将该纯化物，70℃溶解溶于乙腈，4℃结晶5h，过滤得到晶体，用冷冻的乙腈洗涤两次晶体，用真空干燥器将晶体干燥。将干燥的晶体仍按上述方法进行重结晶，用真空干燥器将晶体干燥。茄尼醇的的质量纯度为97.9％，总收率为78.32％。
实施例9.茄尼醇的制备2
将实施例2，3制备的香料浸膏，按照体积比1:40的比例溶于90％乙醇中，加入4％的固体NaOH，混匀，70℃皂化2h，将pH调到2，过滤，用石油醚萃取三次，得到澄清溶液，将正己烷蒸干，得到皂化浸膏，皂化后，得到皂化浸膏，皂化收率为145％，提取和皂化得到的绿原酸为89.8％。将该浸膏以15mg/ml的浓度溶于90％乙醇中，上样大孔树脂HPD600，洗脱条件为90％乙醇2BV，95％乙醇12BV。用TLC或者HPLC法检测各馏分的茄尼醇，收集洗脱液，分别进行浓缩至干，即得到茄尼醇的纯化物。将该纯化物，在室温溶解溶于丙酮，-10℃结晶5h，过滤得到晶体，用冷冻的丙酮洗涤两次晶体，用真空干燥器将晶体干燥。将干燥的晶体用乙腈进行重结晶，用真空干燥器将晶体干燥。茄尼醇的质量纯度为95.2％，总收率为61.1％。
实施例10.香料精品的制备
将实施例8，9茄尼醇制备中大孔树脂层析的流穿液收集合并，蒸干、脱水，可制备得到香料的精品，新植二烯的质量纯度为10.6％，总收率为79.5％，不含有烟碱、绿原酸和芦丁，茄尼醇的质量纯度低于1％。
实施例11.绿原酸的制备1
将实施例5中得到的绿原酸浸膏溶于15％乙醇水溶液，浓度为20mg/ml,pH 3，进行AB-8大孔树脂层析，上样结束后，用35％乙醇洗脱6-8倍柱体积，用TLC或者HPLC法检测各馏分的绿原酸，收集含有绿原酸的馏分，回收乙醇后，将水溶液用乙酸丁酯萃取4次，回收乙酸丁酯得到树脂纯化物，该纯化物再次用水溶解，调pH3，用乙酸丁酯萃取2次，干燥脱水后，回收乙酸丁酯蒸发至干，得绿原酸，质量纯度为73％，总收率为83.5％。溶解于50℃无水乙醇，降温至室温，养晶时间为4小时，得到绿原酸纯品，质量纯度97.0％，总收率为72.5％。
实施例12.绿原酸的制备2
将实施例5中得到的绿原酸浸膏溶于水，浓度为10mg/ml,pH 2，进行XDA-1大孔树脂层析，上样结束后，用30％乙醇洗脱6-8倍柱体积，用TLC或者HPLC法检测各馏分的绿原酸，收集含有绿原酸的馏分，回收乙醇后，将水溶液用乙酸乙酯萃取5次，回收乙酸乙酯得到树脂纯化物，该纯化物再次用水溶解，调pH2，用乙酸乙酯萃取5次，干燥脱水后，回收乙酸乙酯蒸发至干绿原酸的纯度为76％。使用水饱和乙酸乙酯溶解结晶，得到绿原酸，质量纯度98.0％，总收率为71.9％。
实施例13.制备用于微生物菌肥的微生物种子液
取1mL在LB培养基中活化培养20h的枯草芽孢杆菌菌液接种于100mL枯草芽孢杆菌种子培养基进行扩大培养，200r/min、37℃摇床培养20h，OD620达到4～6，即为枯草芽孢杆菌种子液。
取1mL在LB培养基中活化培养20h的胶质芽孢杆菌菌液接种于100mL胶质芽孢杆菌种子培养基进行扩大培养，200r/min、30℃摇床培养20h，OD620达到4～6，即为胶质芽孢杆菌种子液。
取1mL在PDA培养基中活化培养20h的淡紫拟青霉菌菌液接种于100mL淡紫拟青霉菌种子培养基进行扩大培养，200r/min、30℃摇床培养20h，OD620达到4～6，即为淡紫拟青霉菌种子液。
实施例14.提取后残渣制备微生物菌肥-1
将干烟叶残渣35g和水49g置于250mL细口锥形瓶中，115℃灭菌20min。接入实施例13中制备总质量10％的混菌种子液(三种菌的比例为1:1:1)，在30℃恒温箱内静置培养，每隔48h翻料一次。活菌的总数在第8天达到最大值，合计为1.5×1015cfu/g，芽孢总数在第10天达到2.5×1011cfu/g，培养时间延长，芽孢数继续增加。
实施例15.提取后残渣制备微生物菌肥-2
将干烟叶残渣70g、49g实施例6中的萃余液III，49g水，置于500mL锥形瓶中，115℃灭菌20min。接入实施例13中制备枯草芽孢杆菌种子液，在30℃恒温箱内静置培养，每隔24h翻料一次，第7天枯草芽孢杆菌的活菌数为9×108，培养时间延长，芽孢数继续增加。因有效成份萃取较为完全，萃余液无需处理就可以用于微生物菌肥的制备，减少了废水的排放。
对比例1.弱极性有机溶剂提取法制备香料
称取10g烟叶样品置于1L圆底三口烧瓶中，加入600mL石油醚，40℃热回流30分钟，共提取三次，合并得回流液，GC和HPLC分析表明在回流液中新植二烯和烟碱的收率分别为71.2％和4.7％，低于实施例2和3提取液中两成分的收率。将回流液合并蒸馏、干燥后得到香料提取物0.35g，香料浸膏的得率为3.5％，香料浸膏中新植二烯和烟碱的含量分别为3.1％和4.2％，该方法获得的香料浸膏，烟碱含量高。
对比例2.回流液冷却法提取分离烟碱、茄尼醇、绿原酸和芦丁
(1)将实施例1中的回流液回收乙醇后，冷却至4℃，离心得沉淀，测得沉淀中芦丁的含量为回流液中芦丁总含量的15％，该沉淀用乙醇溶解，按照体积质量比20:1加入NaOH，55℃皂化1h,分析皂化液中有效成分含量，未检测到芦丁，该有效成分在皂化过程中被破坏。
(2)上述步骤(1)中，分离沉淀后的上清液调pH 2，用等体积乙酸乙酯萃取，获得绿原酸粗品。绿原酸粗品中芦丁的含量为分离沉淀后的上清液中芦丁总含量的25％，绿原酸粗品中绿原酸的纯度为8％，均远低于实施例5所记载的结果(绿原酸纯度13％)。其原因，是由于芦丁在乙酸乙酯中的可溶解性，致使部分芦丁被萃取进而混入绿原酸粗品中，严重影响绿原酸纯度和随后步骤中芦丁的总收率。
(3)将步骤(2)萃取绿原酸后的余液，调pH为1，4℃下沉淀9小时，获得沉淀为芦丁粗品，芦丁沉淀收率为68％，芦丁的总收率为43.4％。如前文所述，由于芦丁在冷却制备茄尼醇和绿原酸萃取时大量损失，导致收率降低，远远低于实施例4中的芦丁沉降收率85％，总收率71％的结果。
(4)将步骤(3)中芦丁沉淀后的余液，调pH为11,石油醚萃取4次，获得烟碱粗品，总收率为80.5％，纯度为66.6％。对比例的茄尼醇分离，未如实施例2，3经过酸性有机溶剂萃取，溶液中有大量的弱极性成份物质，造成烟碱的纯度也远低于显著低于实施例6，7中99％的烟碱纯度。