本发明属于植物科学研究领域，具体地说，涉及一种拟南芥基因突变体的鉴定方法。
背景技术
植物学界，科研工作者们常通过拟南芥基因突变体对基因功能进行研究。拟南芥基因突变体的构建，有一种途径是通过在基因的外显子区，通过增加、修改或缺失一个或几个碱基，导致mrna的合成提前终止或改变即将翻译的氨基酸，导致mrna翻译出错误的多肽链，进一步进行错误折叠，使基因功能缺失。
现有技术对突变体或野生型的鉴定，多是通过在突变体两端设计引物，对可能突变的区段进行pcr扩增，将扩增产物纯化，交送专业的测序机构对扩增片段进行测序鉴定，并通过测序报告进行分析扩增区段是否发生了基因突变。
综上所述，现有技术存在的问题是：传统的测序方式鉴定时间成本较高，pcr的合成完毕并交送测序公司后，常需要一到两天甚至更长的时间；经济成本高，每个样本进行测序，测序公司不同其测序价格在15-50元不等，进行几百个样本进行测序则需要上千元甚至过万元，花费大量的金钱。对于大多数对测序实验依赖性不高的实验室购买专业的测序仪器不仅仪器价格昂贵，而且性价比低；假阳性高，测序公司广泛采用的第二代测序速度、价格、读长优于第一、三代测序，但其精确度不高，存在单碱基突变未检测出或检测到其他碱基假突变的可能，或重复序列可能存在读取错误。一旦发生会对后续实验造成极大的影响。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种拟南芥基因突变体的鉴定方法。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种拟南芥基因突变体的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、通过已有的dcapsfinder2.0网站，对野生型拟南芥、基因突变体拟南芥的基因突变区段进行序列分析，分析两片段的差异部分，与限制性核酸内切酶酶切位点数据库进行比对，分析潜在的酶切位点，并提供推荐的片段引物及相应的限制性核酸内切酶酶切位点；如没有直接对应的内切酶酶切位点，利用pcr的容错性，通过修改dcapsfinder2.0的相关参数，改变允许碱基错配数，分析产生相应的引物及限制性核酸内切酶酶切位点；
步骤2、然后进行引物合成和pcr扩增，扩增出含有酶切位点的核酸片段；
步骤3、通过特定的限制性核酸内切酶酶切，切出野生型、突变体两者大小不同的片段；
步骤4、通过核酸凝胶电泳，在琼脂糖凝胶中区分条带大小；
步骤5、利用核酸电泳成像系统查看每个样品的样品核酸条带的大小，分析样品基因为正常、突变或杂合情况。
可选地，所述拟南芥基因突变体为突变体abi4-1基因。
可选地，所述步骤1中的限制性核酸内切酶为内切酶bamhi，其酶切位点为ggatcc。
可选地，所述的引物包括上游引物序列：5’-gccaccgtaggaggaggatc-3’，如seqidno.1所示；和下游引物序列为5’-tgttggaattgtcccatctgga-3’，如seqidno.2所示。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
相对传统测序鉴定点突变体，本发明可重复性高，工作耗时时仅为传统鉴定的30％及以下，每个样品鉴定成本降低了80％以上。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明根据参考文献确定点突变的位点及突变方式，突变体abi4-1来源于469位的g缺失突变；
图2是本发明在搜索到相应基因后找到sequenceviewer；
图3是本发明图中所示为2号染色体的序列信息，下划线部分为目标基因；
图4是本发明目标基因abi4序列信息，灰色部分分别为起始密码子和终止密码子；下划线部分为外显子；该基因是一个不含内含子的基因；
图5是本发明电泳结果分析示例，其中，m为dna条带大小显示剂，左侧“100bp”及“200bp”为100bp和200bp长度dna的指示大小；wt为拟南芥野生型abi4电泳条带，条带相对靠近100bp；abi4为拟南芥abi4-1突变体电泳条带，条带相对靠近200bp；h2o为水做电泳的负对照，无条带；hetro为abi4-1杂合突变体条带，具有与wt和abi4大小一致的两条电泳条带。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
一种拟南芥基因突变体的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1、通过已有的dcapsfinder2.0网站，对野生型拟南芥、基因突变体拟南芥的基因突变区段进行序列分析，分析两片段的差异部分，与限制性核酸内切酶酶切位点数据库进行比对，分析潜在的酶切位点，并提供推荐的片段引物及相应的限制性核酸内切酶；如没有直接对应的内切酶酶切位点，利用pcr的容错性，通过修改dcapsfinder2.0的相关参数，改变允许碱基错配数，分析产生相应的引物及限制性核酸内切酶；
其中，所述拟南芥基因突变体为突变体abi4-1基因。
限制性核酸内切酶为内切酶bamhi，其酶切位点为ggatcc。
引物包括上游引物序列：5’-gccaccgtaggaggaggatc-3’，如seqidno.1所示；和下游引物序列为5’-tgttggaattgtcccatctgga-3’，如seqidno.2所示。
步骤2、然后进行引物合成和pcr扩增，扩增出含有酶切位点的核酸片段；
步骤3、通过特定的限制性核酸内切酶酶切，切出野生型、突变体两者大小不同的片段；
步骤4、通过核酸凝胶电泳，在琼脂糖凝胶中区分条带大小；
步骤5、利用核酸电泳成像系统查看每个样品的样品核酸条带的大小，分析样品基因为正常、突变或杂合情况。
实施例2
以abi4(at2g40220)突变体abi4-1(cs8104)点突变体为例，总结dcaps引物设计流程，需网站tair(http://www.arabidopsis.org/),dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html):
1、根据参考文献找出突变位点。突变体abi4-1的来源是由于第469位的g被缺失掉，导致移码突变(图1)。突变后的蛋白，仍然具有dna结合能力，但失去了转录激活的能力。
2、内切酶及引物的选取。选取450-510的cds序列作为野生型序列，将上述序列469位点的g删除作为突变体序列。两序列分别含有60个及59个碱基(dcapsfinder2.0所需序列长度的上限为60碱基)。将碱基错配数设定为1，然后点击“submit”。得到能够切开野生型反向序列的内切酶bamhi(酶切位点ggatcc，引物序列5’-gccaccgtaggaggaggatc-3’)。其中，如果所给引物过短，可以考虑重新设计或者在引物酶切位点相反方向增加若干碱基。
3、根据dcapsfinder2.0所给引物，通过数据库查询决定第二条引物；第二条引物序列为：5’-tgttggaattgtcccatctgga-3’。酶切鉴定过程中，pcr产物控制在150bp左右，切除碱基数量最好大于20bp。
4、查看pcr产物是否跨越内含子。将wt基因输入tair，找到sequenceviewer(图2)，点击图3中的“at2g40200.1”处(即图3中下划线处)，找到目标基因即可比对是否跨越内含子(图4)；从图4可以看出，该基因是一个不含内含子的基因。
5、确定最终的pcr产物序列：将所得引物与设计引物所用的序列信息(通常选择wtforward序列)进行比对(反向引物需要进行反向互补以后在进行比对)，将wt序列中未进行错配的碱基按照反向引物进行修改即可。根据以上操作，本案例设计的引物为上游引物(fw):5’-gccaccgtaggaggaggatc-3’，下游引物(rev):5’-tgttggaattgtcccatctgga-3’。将该引物序列交送引物合成公司进行合成。
6、pcr扩增片段及鉴定：将待鉴定拟南芥的基因组dna、dcaps设计的引物，taqdna合成酶及试剂按taqdna合成酶说明书按比例进行混合，进行pcr扩增。pcr扩增完成后，取部分扩增产物，进行bamhi酶切反应。酶切反应完成后进行3％的琼脂糖凝胶电泳，通过电泳结果分析鉴定样品情况(图5)，由图5可知，wt为拟南芥野生型abi4电泳条带，条带相对靠近100bp；abi4为拟南芥abi4-1突变体电泳条带，条带相对靠近200bp；h2o为水做电泳的负对照，无条带；hetro为abi4-1杂合突变体条带，具有与wt和abi4大小一致的两条电泳条带。
在耗时方面：传统鉴定方式首先进行dna的提取，基因突变位点附近的片段扩增、送测序公司进行序列测定，随后与数据库信息进行比对，所用时间至少需要24小时，而本发明仅需dna提取、片段扩增、酶切及数据比对，开始实验至获取结果所用时间不超过7小时。相对传统测序鉴定点突变体，本发明的工作耗时时仅为传统鉴定的29.1％。
在成本方面：传统方式单个样品的测定成本约￥28.78(dna提取成本约￥1.00，dna的扩增成本￥7.98，测序费￥20.00，总计￥28.78)，本发明鉴定方式成本约为￥3.60(dna提取成本约￥1.00，dna扩增成本￥0.60，酶切及电泳成本￥2.00，总计￥3.60)。相对传统测序鉴定点突变体，本发明的每个样品鉴定成本降低了87.5％。
其中，传统方法所需要的dna片段保真程度要求高，扩增片段不能出现错误，需要质量更高的dna聚合酶；本发明对dna片段保真性要求较低，无需质量更高的dna聚合酶，因此传统方案dna扩增成本更高。
本发明的可重复性高：由于测序在gcrich及dna存在复杂结构的情况下可能出现测序数据读取错误；dna为短片段的情况下两端读取困难，无法正确测序。由于以上两点，可能造成得到错误结果，而本发明则可避免以上情况，具有可重复性高的优点。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种拟南芥基因突变体的鉴定方法
<130>2018
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gccaccgtaggaggaggatc20
<210>2
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tgttggaattgtcccatctgga22