本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及胸腺法新的制备方法及含有胸腺法新的药物组合物。
背景技术：
：胸腺法新(thymosinα1，又称胸腺素α1)，分子式为c129h215n33o55，是由28个氨基酸组成的多肽，相对分子质量为3108.28，为白色或类白色粉末，其氨基酸组成序列为n-ac-ser-asp-ala-ala-val-asp-thr-ser-ser-glu-ile-thr-thr-lys-asp-leu-lys-glu-lys-lys-glu-val-val-glu-glu-ala-glu-asn-oh。80年代初美国的merrifield等实验室人工合成了胸腺法新，目前，美国sciclone和意大利sclavospa的胸腺法新产品，已在意大利等多个国家上市，商品名为zadxin(日达仙)，早在上世纪末就已进入中国市场。中国专利cn201210052504公开了一种胸腺法新的纯化方法，具体步骤包括活性炭吸附过滤、中性氧化铝色谱柱分离、超滤膜浓缩、乙醚沉降离心洗涤、干燥。中国专利cn201110186259采用反相c18填料，依次采用0.1％tfa/乙腈、0.2％磷酸/乙腈和水/乙腈分别对胸腺法新粗肽进行第一次、第二次纯化和转盐制备。产品冻干后纯度达99％以上。中国专利cn200910304817提供了一种胸腺法新脱盐工艺。其工艺步骤为：将酸化后的胸腺肽α1溶液与阳离子交换树脂混合后先用水洗脱离子交换树脂，再用碱性溶液洗脱交换树脂，收集在230nm波长处有吸收的洗脱液，最后经浓缩干燥，得胸腺法新。具有样品处理量大，脱盐效率好，可重复上样，适合于工业化大生产的特点。现有胸腺法新的固相合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已知的杂质包括：d-asn28-胸腺法新、asp28-胸腺法新、di-ala4-胸腺法新等，未知杂质还有很多。胸腺法新是一种多肽，对酸碱度、温度等都很敏感，且在水中的稳定性差。为了增加胸腺法新制剂的稳定性，临床上将其制备成冻干粉针，且要求在2～8℃条件下保存，但注射用胸腺法新在生产环节上，需要使用2～8℃的注射用水配制灌装才能保证制剂的质量。中国专利申请201110220652公开了一种含有胸腺法新的药用组合物及其制备方法，该药物组合物含有以下成分：胸腺法新、甘露醇、山梨醇0.01m醋酸-醋酸钠缓冲溶液调节ph至3.8～4.2，但是正常人体血液的ph值为7.35～7.45，在此范围外的溶液会对血管内皮细胞造成损伤，并诱发血小板聚集和激发的血栓性静脉炎的链式反应。技术实现要素：为解决上述现有技术中所存在的问题，我们进行了大量的试验探索，发现添加磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液以及一定比例的聚右旋糖和甘氨酸可以明显提高胸腺法新注射制剂的稳定性。具体而言，本发明提供了：一种胸腺法新的纯化方法，包括以下步骤：步骤1：将胸腺法新粗品溶解在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液中，以葡聚糖g型凝胶为固定相，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为流动相，收集目的峰获得第一洗脱液，冻干；步骤2：将第一洗脱液的冻干粉溶解于流动相a中，以氰基硅烷键合硅胶为固定相，以质量浓度为0.05～0.1％高氯酸的1％乙腈水溶液为a相，质量浓度为0.05～0.1％高氯酸的95％乙腈水溶液为b相，梯度为40％b→70％b，进行第二次纯化，线性梯度洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用滤膜过滤，浓缩；步骤3：向浓缩液中缓慢加入乙醚，搅拌，在4-6℃下静置10-12小时后，析出胸腺法新。所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的ph为2.0～4.0。一种含有胸腺法新的药物组合物，包含胸腺法新、赋形剂、缓冲对，其特征在所述的赋形剂为右旋糖和甘氨酸组成的混合物。所述组合物包含以下重量份的成分：1.5～2重量份胸腺法新、40-60重量份赋形剂、缓冲对适量。所述赋形剂中聚右旋糖为喷雾干燥聚右旋糖。所述赋形剂中聚右旋糖和甘氨酸的重量比为(3～5)：1。所述药物组合物中使用的缓冲对为ph＝7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。所述的组合物的ph值为6.6～7.5。一种含有胸腺法新的药物组合物制备冻干粉针的方法，该方法包括以下步骤：取赋形剂溶解于2/3处方量的注射用水中，搅匀；加入处方量胸腺法新，测ph值，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节ph至6.6～7.5，加入注射用水至全量，用微孔滤膜精滤，冻干得冻干粉针。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1、采用本发明方法纯化的胸腺法新中，测定的杂质[d-ser1]-胸腺法新和[d-asn28]-胸腺法新均小于0.07％。2、由该组合物制得的冻干粉针剂稳定性良好，复溶性好；由该组合物制得的冻干粉针剂使用方便，利于贮运，其制备方法简单，易于工业化生产，且生产成本低。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。按cn1390853a的方法制备的胸腺法新粗品，经检测其hplc纯度为94.52％。实施例1步骤1：将胸腺法新粗品5g用ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，制成浓度200mg/ml的溶液，以sephadexg-15为固定相，以ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为流动相，洗脱速度为2ml/min，洗脱20min，检测波长为210nm，收集目的峰获得第一洗脱液，冻干；步骤2：将第一洗脱液的冻干粉4.2g溶解于流动相a中，以ymc-packcn为固定相，以质量浓度为0.05％高氯酸的乙腈水溶液a(体积比为99％水/1％乙腈)为a相，质量浓度为0.05％高氯酸的乙腈水溶液b(体积比为5％水/95％乙腈)为b相，流速为60ml/min，洗脱30min，梯度为40％b→70％b，进行第二次纯化，检测波长为210nm，收集纯度大于95％以上洗脱液，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤，浓缩；步骤3：向此浓缩液中缓慢加入8ml乙醚，搅拌，在4-6℃温度下静置10-12小时后，将析出的胸腺法新干燥，得纯度为99.93％的胸腺法新2.82g，纯化总收率为56.4％。实施例2步骤1：将胸腺法新粗品8g溶解在ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液溶解，制成浓度250mg/ml的溶液，以sephadexg-25为固定相，ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为流动相，洗脱速度为5ml/min，洗脱20min，检测波长为210nm，收集目的峰获得第一洗脱液，冻干；步骤2：将第一洗脱液的冻干粉7.1g溶解于流动相a中，以ymc-packcn为固定相，以质量浓度为0.1％高氯酸的乙腈水溶液a(体积比为99％水/1％乙腈)为a相，质量浓度为0.1％高氯酸的乙腈水溶液b(体积比为5％水/95％乙腈)为b相，流速为75ml/min，洗脱25min，梯度为40％b→70％b，进行第二次纯化，检测波长为210nm，收集纯度大于95％以上洗脱液，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤，浓缩；步骤3：向此浓缩液中缓慢加入10ml乙醚，搅拌，在4-6℃温度下静置10-12小时后，将析出的胸腺法新干燥，得纯度为99.81％的胸腺法新4.87g，纯化总收率为60.9％。实施例3步骤1：将胸腺法新粗品50g溶解在ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，以sephadexg-15为固定相，以ph2.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液为流动相，洗脱速度为25ml/min，洗脱50min，检测波长为210nm，收集目的峰获得第一洗脱液，冻干；步骤2：将第一洗脱液的冻干粉41.3溶解于流动相a中，以ymc-packcn为固定相，以质量浓度为0.08％高氯酸的乙腈水溶液a(体积比为99％水/1％乙腈)为a相，质量浓度为0.08％高氯酸的乙腈水溶液b(体积比为5％水/95％乙腈)为b相，流速为75ml/min，洗脱25min，梯度为40％b→70％b，进行第二次纯化，检测波长为210nm，收集纯度大于95％以上洗脱液，将洗脱液用0.22μm滤膜过滤，浓缩；步骤3：向此浓缩液中缓慢加入300ml乙醚，搅拌，在4-6℃温度下静置10-12小时后，将析出的胸腺法新干燥，得纯度为99.82％的胸腺法新34.38g，纯化总收率为68.76％。测试例1：有关物质取本品适量，精密称定，加0.02mol/l(ph7.0)磷酸盐缓冲液溶解并稀释制成含0.5mg/ml胸腺法新的溶液作为供试品溶液；精密量取2ml，置于100ml容量瓶中，加0.02mol/l(ph7.0)磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，精密量取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入hplc，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，除溶剂峰和醋酸峰外，[d-asn28]-胸腺法新不得大于2.0％，[d-ser1]-胸腺法新不得大于1.5％，其它单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(2.0％)，各杂质峰峰面积之和不得大于对照液色谱图中主峰的峰面积的2倍(4.0％)含量测定照高效液相色谱法(通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以硫酸铵缓冲液(取硫酸铵26.4g，磷酸25ml加水溶解并稀释至2000ml)-乙腈(90:10)为流动相a，以硫酸铵缓冲液-乙腈(50:50)为流动相b；柱温为50℃；检测波长为210nm；按下表进行梯度洗脱。取胸腺法新对照品与[d-ser1]-胸腺法新和[d-asn28]-胸腺法新对照品各适量，加0.02mol/l鱗酸盐缓冲液(ph7.0)溶解并稀释制成每lml中含[d-ser1]-胸腺法新和[d-asn28]-胸腺法新各50μg、含胸腺法新0.5mg的混合溶液，取20μl注入液相色谱仪，调节洗脱梯度表45分钟处的流动相b的比例使胸腺法新的保留时间约为30分钟，记录色谱图。理论板数按胸腺法新峰计算不低于2000，杂质i峰与胸腺法新峰之间的分离度应大于1.2。表1梯度流动相时间(分钟)流动相a流动相b(％)08812458218505050518812608812测定法取本品适量，精密称定，加0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)溶解并定量稀释制成每lml中含胸腺法新0.5mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取胸腺法新对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。结果表2。表2不同制备方法得到的胸腺法新杂质含量检测对比例1：cn201210052504实施例1结论：上述结果表明本发明制备的胸腺法新的总有关物质均小于0.2％，[d-asn28]-胸腺法新小于0.07％，[d-ser1]-胸腺法新小于0.05％，其它单个最大杂质小于0.05％，均优于原料和对比例1。实施例4在洁净的条件下，将37.5g聚右旋糖和12.5g甘氨酸投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，加入1.6g胸腺法新(按实施例3所述方法制得)，测ph值，用ph＝7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节ph至7.0，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到胸腺法新滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例5在洁净的条件下，将46.4g聚右旋糖和11.6g甘氨酸投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，加入1.9g胸腺法新(按实施例2所述方法制得)，测ph值，用ph＝7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节ph至7.0，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到胸腺法新滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例6在洁净的条件下，将50g聚右旋糖和10g甘氨酸投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，加入2.0g胸腺法新(按实施例1所述方法制得)，测ph值，用ph＝7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节ph至6.9，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到胸腺法新滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。实施例7在洁净的条件下，将35g聚右旋糖和10g甘氨酸投入配液器具中，加入注射用水700ml中搅拌溶解，加入1.9g胸腺法新，测ph值，用ph＝7.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调节ph至6.9，加入注射用水至全量，经0.22μm微孔滤膜过滤，得到胸腺法新滤液。分装3ml于安培瓶中，冷冻干燥72小时制成无菌冻干粉针剂。处方筛选试验1、制剂缓冲体系的筛选配制乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.5)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1m，ph＝4.8)、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1m，ph＝7.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.1m，ph＝7.4)。参照中国药典2010版二部凡例项下的方法测定胸腺法新在各缓冲液中的溶解度，具体为：称取适量样品，于25℃±1℃一定量的溶液中，每隔5分钟强力振荡30秒，观察30分钟内的溶解情况，无目视可见的溶质颗粒时视为溶解。试验结果见表3，从溶解度角度判断，制剂溶液优选磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为缓冲液。表3胸腺法新在缓冲液中的溶解度2、在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的稳定性分析配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1m，ph＝7.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(0.1m，ph＝7.4)，称取一定量胸腺法新溶入其中，形成浓度为2.1mg/ml溶液，放置于37℃孵箱孵浴，于0、1、2、4、8、12小时对其中胸腺法新纯度进行hplc检测，试验结果见表4。从稳定性角度判断，制剂溶液优选磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为缓冲液。表4胸腺法新在缓冲液中的纯度(％)3、制剂溶液中赋型剂的筛选(一)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1m，ph＝7.0)，含有胸腺法新1.6mg/ml。且分别含有4％(w/v)的甘露醇、聚右旋糖与甘氨酸(重量比4:1)的组合物、山梨醇、乳糖作为赋型剂。放置于37℃孵箱孵浴，检测各时间点溶液中胸腺法新的稳定性。并进行冻干(冻干程序为：－40℃预冻4小时；抽真空至300mt；设置升温程序1℃/分钟，升至－20℃；冻干12小时；设置升温程序1℃/分钟，升至30℃；干燥4小时；压塞并轧盖。)，观察其冻干形式制剂的外观，试验结果如表5。从稳定性和冻干外观角度判断，制剂溶液优选甘露醇或聚右旋糖与甘氨酸的组合物作为赋型剂。表5胸腺法新在含有赋型剂制剂溶液缓冲液中的纯度(％)和冻干外观4、制剂溶液中赋型剂的筛选(二)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1m，ph＝7.0)，含有胸腺法新0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.6、3.2或6.0mg/ml。且分别含有4％(w/v)的甘甘露醇、聚右旋糖与甘氨酸的组合物(重量比4:1)、山梨醇、乳糖作为赋型剂。同时配制不含有赋型剂的制剂溶液。取玻璃瓶，按1ml/瓶分装上述制剂溶液，冻干。考察冻干形式的药物制剂复溶情况。试验结果如表6。表6制剂溶液中含有不同赋型剂时冻干制剂，复溶后制剂的澄清度注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液本试验结果显示，引入甘露醇、或聚右旋糖、或山梨醇等赋型剂等溶质分子，仅将制备可溶解冻干制剂的药物制剂溶液中胸腺法新的浓度范围由0～0.1mg/ml提高到0～0.25mg/ml，稍微提高了冻干后可复溶药物制剂中胸腺法新浓度；有些赋型剂的引入(例如乳糖)对提高冻干后可复溶药物制剂中胸腺法新浓度的影响不大。5、制剂溶液中赋型剂的筛选(三)配制制剂溶液，其中磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(0.1m，ph＝7.0)，不同重量比聚右旋糖与甘氨酸组合物、胸腺法新1.6mg/ml，用水调配而成。采用pb-10型ph计(美国sartorius公司)，按照《中华人民共和国药典2010版二部》附录vih有关ph值检测的要求进行检测。检测制剂溶液中胸腺法新的溶解度。将制剂溶液装入2ml玻璃冻干瓶，1ml/瓶，移入低温冷冻干燥机(supermodulyo型，0.4m2，e-capparatus公司)产品柜冻干。以1ml注射用水复溶冻干的制剂，考察冻干形式的药物制剂复溶情况。冻干的制剂放入37℃孵箱，孵浴8周后每瓶用1ml注射用水复溶，检测制剂溶液中胸腺法新的纯度。不同重量比的聚右旋糖与甘氨酸的制剂溶液ph值、冻干后冻干形式制剂的外观和复溶情况，以及冻干形式的制剂在37℃放置8周后胸腺法新的纯度如表7所示，各制剂溶液冻干后胸腺法新的纯度检测均为99.86％。通过制剂溶液ph、冻干形式制剂外形和冻干制剂的稳定性综合判断，优选聚右旋糖和甘氨酸重量比为(3～5)：1。冻干形式的药物制剂均可用1ml至5ml注射用水复溶，重新制成液体药物制剂。表7制剂溶液中含有不同赋形剂浓度下的ph、冻干外观、重溶时间和8周稳定性注：<1指浊度小于1号标准液；>1指浊度大于1号标准液。试验结论：通过上述试验表明，选用聚右旋糖和甘氨酸的重量比为3～5：1为赋形剂，具有更好的产品质量。注射用胸腺法新试验例1、仪器与药品高效液相色谱仪(hp1100型，美国惠普公司)，dad检测器，agilentchemstation色谱工作站：yb-2型澄明度检查仪(天津大学精密仪器厂)；du640型紫外分光光度仪(美国贝克曼公司)；phs-3c型数字酸度计(上海雷磁仪器厂)；ws/08-0l型调温调湿箱(杭州蓝天仪器生产有限公司)；metyler.ae200型分析天平(瑞士)；注射用胸腺法新(根据实施例6所述制备的样品)。2、方法2.1色谱条件十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-磷酸(140：860：1)为流动相a；以乙腈-水-磷酸(250：750：1)为流动相b，检测波长为210nm。按下表进行梯度洗脱；理论板数按胸腺法新峰计算不低于2000。胸腺法新峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。2.2考察项目及方法2.2.1酸度：取注射用胸腺法新胸腺法新样品，加水制成0.5mg/ml的溶液，采用酸度计直接测定。结果ph值为6.6～7.5。2.2.2溶液的澄清度与颜色：取注射用新胸腺法5支，分别加水制成1mg/ml的溶液，照溶液颜色检查法，各批样品溶液均澄清、无色。2.2.3澄明度：取注射用新胸腺法5支，分别加注射用水制成1mg/ml的溶液，依中国药典检查，均符合规定。2.2.4有关物质：取本品，加0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)溶解并稀释制成每1ml中含胸腺法新0.5mg的溶液作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，加0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.0)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10％。再精密量取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，除溶剂峰和醋酸峰外，单个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(2.0％)，各杂质峰面积总和不得大于对照溶液主峰面积的2倍(4.0％)。2.2.5含量测定：照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录ⅴd)测定。2.3影响因素实验在上市药品包装条件下，将三批实施例6样品(批号为170305，170307，170309)在高温(60℃)、强光(4500lx)、高湿条件下考察5、10天，对其酸度、含量及有关物质等指标进行考察，各项指标均符合规定。测定结果见表9。表9影响因素试验结果a、b、c代表实施例6的三批样品，批号为170305、170307、170309的样品。2.6加速实验在上市药品包装条件下，将三批实施例6样品(批号为170305，170307，170309)在温度(40±2)℃、相对湿度75％土5％条件下存放，分别于0、1、2、3、6个月末取样，测定各项指标。各批样品性状均为白色疏松块状物。符合规定，溶液澄清度与颜色、澄明度均符合规定。酸度、有关物质和含量测定结果见表10。2.7长期实验在上市药品包装条件下，将三批实施例6样品(批号为170305，170307，170309)在温度(25±2)℃、相对湿度60％±10％条件下存放，分别于0、3、6、12、18、24个月末取样，测定各项指标。各批样品性状均为白色疏松块状物，符合规定，溶液澄清度与颜色、澄明度符合规定，酸度、有关物质和含量测定结果见表10。表10加速试验和长期试验考察结果a、b、c代表实施例6的三批样品，批号为170305、170307、170309的样品。结论：影响因素试验、加速试验结果显示，注射用胸腺法新各项测定指标无明显变化，稳定性良好；长期室温条件下放置注射用胸腺法24个月各项质量指标无明显变化，产品稳定性良好。注射用胸腺法新复溶后的稳定性测定试验将170305、170307、170309、中国专利申请201210052708的样品用注射用水250ml复溶后，置于4℃冰箱中，每天测定一次，连续测定14天，以测定值(y)对时间(x)进行直线回归分析。结果如表11所示。表11注射用胸腺法新复溶后的稳定性注：p>0.05说明胸腺法新在所测定的时间内基本稳定。结论：从表11可知，本发明三批产品复溶后连续测定14天后，胸腺法新保持含量稳定。说明本发明所示方法制备的注射用胸腺法新复溶后性质稳定。当前第1页12