本发明属于微生物领域，涉及一种埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8及其应用。
背景技术：
魔芋又称鬼芋、蒟蒻等，属被子植物门、单叶植物纲、天南星科魔芋属，多年生草本块茎植物，具有重要的药用、保健功能及观赏价值。魔芋块茎富含葡甘聚糖(kgm)，可广泛用于食品、医疗、化工、造纸、纺织、石油等行业，被称为“东方魔粉”。我国是魔芋生产大国，占世界总产量60％，魔芋精粉年产量约为1.5万吨。但是，魔芋软腐病的危害严重影响了魔芋产业的发展，特别是随着连作和种植面积的扩大，软腐病的发病率越来越高，每年基本达到20-30％，高温多雨季节更高达50％左右。该病害造成的损失一般在30％左右，严重者可达80％甚至绝收，被称为魔芋的“癌症”。目前尚未针对软腐病的抗病品种，也没有特效药剂，严重制约着魔芋产业发展。魔芋软腐病的防治主要依赖普通药剂，如农用链霉素，多效霉素，宁南霉素、多菌灵、腐烂灵、芋腐灵、硫酸铜等进行防治，但防治效果不理想，急需寻找有效防治方法。农药的过度使用和不当滥用也容易引起软腐病病菌的抗性，同时造成环境污染、生态破坏、食品污染等严重问题。因此，利用无公害防治技术防治软腐病，减少农药使用量和减轻农药污染，已成为魔芋产业可持续发展的当务之急。利用生物防治技术手段进行植物病害防治，具有安全、高效、无污染等特点，符合绿色植保理念，与生态环境可持续发展吻合，是未来农药发展的必然趋势。技术实现要素：本发明的提供一种埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8及其应用，该菌株能够对多种植物病原真菌和细菌起到很好的拮抗作用，特别是对魔芋软腐病病原菌具有很好的抑制作用，防治魔芋软腐病的效果与化学防治效果无明显差别，并具有促生作用。该菌绿色无污染，是环境友好的新型农药制剂，解决现有技术中存在的问题。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8，保藏编号为cctccno.m2017113，保藏在中国典型培养物保藏中心，该菌株能够对多种植物病原真菌和细菌起到拮抗作用。进一步的，所述埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂的制备方法，包括以下步骤：菌种活化：将4℃保藏的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌株接种至lb固体培养基上，30～37℃培养24～48小时，然后挑取单菌落接种于lb斜面培养基上，30～37℃恒温培养24～48小时；种子液的制备：将上述活化好的菌种接种至lb液体培养基中，30～37℃下摇床培养24～48小时，得到种子液；发酵培养：将种子液接入发酵培养基中，接种量为8％，30～37℃，摇床转速为150～230rpm的条件下培养48～72小时，得到菌液孢子数为109cfu/ml的液体制剂；发酵培养基的组分为：葡萄糖30g、酵母浸粉9g、鱼粉10g、磷酸氢二钾1.5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.6g、水1000ml，ph6。固体菌剂制备：将发酵液与载体混匀后制成微生物菌剂。进一步的，所述载体是麸皮、稻糠的一种或几种。进一步的，所述埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂的使用方法如下，将埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂按1:20～1:100的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂进行灌根、叶面、花蕾和果实表面喷施或全株喷施，或同时喷洒于植物栽培的土壤。本发明的有益效果是本发明埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8能有效抑制多种病原细菌和病原真菌，从而防止植物病害的发生，其主要抑菌成份为抗菌蛋白。尤其适用于魔芋软腐病等植物病原细菌引起土传病害防治。其有益效果在于：抑菌谱广，对多种植物常见细菌病害和真菌病害都有很好的抑菌效果；具有明显的促生作用，对植株生长、提高植物抗逆性具有促进作用；对高温、酸碱和紫外辐射的耐受力较强，具有很强的抗逆性；无污染、无有害残留，是环境友好型生物农药；本发明生产工艺简单、成本低廉，易于推广。附图说明图1是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌落形态图；图2是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8扫描电镜观察图；图3是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8的biolog鉴定图；图4是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对魔芋软腐病病原菌的拮抗作用图；图5是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对水稻恶苗病菌的拮抗作用图；图6是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对番茄早疫病菌的拮抗作用图；图7是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白deae离子层析图(左)和sephadexg-75层析图(右)；图8是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白电泳图谱；图9是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白ls51对甘蓝黑腐病菌的抑制活性图；图10是不同温度处理后埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白ls51对魔芋软腐病菌的抑制活性图；图11是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对魔芋软腐病的盆栽和大田预防试验图；图12是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对魔芋块茎的促生长作用。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。埃吉类芽孢杆菌swl-w8由陕西省微生物研究所在云南腾冲温泉分离得到。对该菌进行了形态、biolog及16srdna鉴定,确定为埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)。菌落凸起，乳白色，表面光滑，湿润。革兰氏阳性菌，菌株形态为长杆状，大小约为0.2～0.5×3～10μm，参见图2。在抗菌谱方面，本发明的菌株埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对魔芋软腐病菌(pectobacteriumcarotovorum)、烟草青枯病菌(ralstoniasolanacearum)、甘蓝黑腐病菌(xanthomonascampestris)、水稻恶苗病菌(fusariummoniliformesheld.)、棉立枯病菌(rhizoctoniasolanikchn)、苹果青霉病菌(penicilliumsp.)、烟草赤星病菌(alternariaalternata)、番茄早疫病菌(alternariasolani)等植物病原菌都有抑制作用。在抗菌机制方面，本发明的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8通过产生抗菌蛋白抑制植物病原菌的生长。在诱导抗性方面，本发明的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8可通过诱导植物蛋白组和抗病相关基因表达水平的变化等，从而提高抗病性能，达到减少病害发生的目的。在促进植物生长方面，本发明的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对魔芋等作物具有很好的促生作用，施用该菌剂后，作物农艺性状均优于对照组。在抗逆性方面，本发明的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8具有对紫外线不敏感，耐高温，耐储存等特点，易于在田间推广使用。在田间防效方面，埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂对魔芋软腐病具有很好的防治作用。从埃吉类芽孢杆菌swl-w8中提取出主要抑菌成分为抗菌蛋白。发酵液经硫酸铵沉淀、透析、deae离子层析柱、sephadexg-75葡聚糖凝胶层析获得约25kd抗菌蛋白。对抗菌蛋白进行生物学特性研究，该蛋白对酸稳定，碱度变大，抑菌活性减低；40℃-80℃处理30min，抑菌活性不变，100℃处理30min抑菌活性下降至74.5％。紫外照射2-24h，蛋白抑菌活性不变。对蛋白酶k和胰蛋白酶不敏感。埃吉类芽孢杆菌swl-w8菌剂制备方法步骤为菌种活化、种子液的制备、发酵培养，获得菌液孢子数为109cfu/ml的液体制剂；发酵培养基的组分为：葡萄糖30g、酵母浸粉9g、鱼粉10g、磷酸氢二钾1.5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.6g、水1000ml，ph6。埃吉类芽孢杆菌swl-w8菌剂对魔芋软腐病的预防效果为78.30％，对魔芋软腐病的治疗作用为74.44％，与常用药剂农用链霉素的防治效果相当，可作为替代药剂使用。同时，施用埃吉类芽孢杆菌swl-w8菌剂后，魔芋全株高，块茎膨大系数等农艺性状均比清水和药剂对照组有所提高，对植物促生长效果明显。一、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8的分离埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8由陕西省微生物研究所在云南腾冲温泉分离得到。从温泉中收集水样，对水样进行梯度稀释，分别将102、103、104倍稀释液100μl，涂布于lb培养基中，32℃恒温培养2天，挑取单菌落继续在lb培养基中划线纯化。将纯化菌种以魔芋软腐病菌为靶标菌进行拮抗菌的筛选。结果筛选出一株对靶标菌有很好拮抗作用的菌株，命名为swl-w8。二、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8的形态、biolog及16srdna鉴定(1)形态观察swl-w8菌株在lb平板上培养，观察菌落形态，并参照周德庆《微生物实验教程》进行革兰氏染色、芽孢染色等。菌落形态如图1所示。菌落凸起，乳白色，表面光滑，湿润。革兰氏阳性菌，菌株形态为长杆状，大小约为0.2～0.5×3～10μm。(2)biolog鉴定参见图3，对菌株swl-w8进行biologgenⅲ分析，将菌株接种到lb培养基上，24h后用棉签将菌落沾起，分散到if-a专用接种液中，制备成均一的菌悬液，调整浊度到52％±2％，接种到genⅲ鉴定板上，接种量150μl，30℃培养24h，在biolog微生物自动分析仪上读取数据。表1不同碳源生化反应测试结果注：+表示阳性反应，-表示阴性反应，b表示边界值(阳性反应不明显)(3)16srdna鉴定提取swl-w8菌株dna，以该dna为模板，采用16srdna通用引物(7f:5'-cagagtttgatcctggct-3'和1540r：5'-aggaggtgatccagccgca-3')进行pcr扩增，pcr产物进行测序，序列大小16srdna为1385bp，通过核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上比对，显示菌株swl-w8为埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)。与埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)tbt3-4基因序列同源性达100％，最终确定菌株swl-w8为埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)。埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)16srdna序列如下：gaccctttcggggtttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcctgtaagactgggataactaccggaaacggtagctaagaccggataagtgattctcttgcatgagaggatcaagaaacacggggcaacctgtggcttacagatgggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgcaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgtcgtggagagtaactgctctgcgaatgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggccgcttaagtctggtgtttaagcccgaggctcaacctcggttcgcactggaaactgggtggcttgagtgcaggagaggaaagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctttctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgccgaagtaaacacaataagcactccgcctggggagtacgctcgcaagagtgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctctgaatatcctagagatagggtaggccttcgggacagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgaacttagttgccagcattgagttgggcactctaagttgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaagcgaagtcgcgagatggagccaatcctaagaaagccggtctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagtcggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtggggtaaaccgcaaggagc本发明提供的埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072；本发明菌株的信息为：埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8，保藏号为cctccno.m2017113，保藏日期为2017年3月。三、供试菌拮抗植物病原菌性能测试参见图4-图6，植物病原细菌采用倒平板法。将植物病原细菌在lb液体培养基中培养24h，吸取1ml菌液加入到融化并冷却至50℃的lb固体培养基中，混匀后倒平板，冷却凝固后在平板的四个角上点接埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8，32℃培养2d后测量抑菌圈大小。lb培养基：胰蛋白胨20g，酵母浸粉，氯化钠，琼脂15-20(液体不加琼脂)，自来水1l，ph7.0-7.2,121℃灭菌20min。植物病原真菌采用平皿对峙培养法。将植物病原真菌接种在pda培养基中，28℃培养5d，用直径9mm的打饼器将病原真菌打成菌饼，在每个pda培养基中央放置一个菌饼，距离菌饼圆心直线距离2cm位置的四个角上接种埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8。同时设对照培养。28℃培养5d后测量病原真菌菌落直径，计算抑制率。抑制率＝(对照病原真菌菌落直径-实验病原真菌菌落直径)/对照病原真菌菌落直径×100％。pda培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000ml，ph值自然。结果显示，埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对多种病原真菌和病原细菌均有较强的抑制作用。表2埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8对不同病原菌的抑制作用四、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白的纯化及对病原菌的抑制性能检测埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8接种于lb斜面，培养24小时，刮取少量菌体接种在lb液体培养基中，30℃，140r/min培养48h。4℃，4000r/min离心收集上清液，在发酵上清液中加入一定浓度的硫酸铵(范围50％-80％)，沉淀，4℃，8000r/min离心收集蛋白沉淀，用ph7.4tris-hcl缓冲液溶解。蛋白溶液用透析袋去除小分子盐等杂质，即得抗菌粗蛋白溶液。粗蛋白经deae高流速琼脂糖微球离子层析，分别用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol/lnacl溶液各100ml洗脱，收集各洗脱峰，进行抑菌活性检测，其中第5个洗脱峰具有抑菌活性。对该洗脱峰进一步用sephadexg-75葡聚糖凝胶层析，获得单一蛋白洗脱峰，即为本发明抗菌蛋白ls51。各层析图谱见图7。蛋白电泳显示抗菌蛋白ls51分子量约为25kd，电泳图见图8。对抗菌蛋白ls51进行生物学特性研究，该蛋白对酸稳定，碱度变大，抑菌活性减低；40℃-80℃处理30min，抑菌活性不变，100℃处理30min抑菌活性下降至74.5％；紫外照射2-24h，蛋白抑菌活性不变；该蛋白对蛋白酶k和胰蛋白酶不敏感。抑菌活性检测方法：病原细菌用lb液体培养24h，吸取1ml菌液至100ml融化后冷却至50℃的lb固体培养基中，倒平板，待平板凝固后，用7mm打孔器打孔，每孔加入蛋白溶液100μl，并用缓冲液做对照。32℃培养24h，观察抑菌效果。结果见图9、图10，埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8抗菌蛋白ls51对病原菌有很好的抑制作用。可见抗菌蛋白ls51是埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8的主要抑菌成分之一。五、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂的制备菌种活化：将4℃保藏的swl-w8菌株接种至lb固体培养基上，30～37℃培养24～48小时，然后挑取单菌落接种于lb斜面培养基上，30～37℃恒温培养24～48小时；种子液的制备：将上述活化好的菌种接种至lb液体培养基中，30～37℃下摇床培养24～48小时，得到种子液；发酵培养：将种子液接入发酵培养基中，接种量为8％，30～37℃，摇床转速为150～230rpm的条件下培养48～72小时，得到菌液孢子数为109cfu/ml的液体制剂；发酵培养基的组分为：葡萄糖30g、酵母浸粉9g、鱼粉10g、磷酸氢二钾1.5g、磷酸二氢钾1g、七水硫酸镁0.6g、水1000ml，ph6。固体菌剂制备：将发酵液与载体(可以是麸皮、稻糠等载体的一种或几种)混匀后制成微生物菌剂。微生物菌剂的使用方法，将微生物菌剂按1:20～1:100的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂进行灌根、叶面、花蕾和果实表面喷施或全株喷施，或同时喷洒于植物栽培的土壤。六、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂在防治魔芋软腐病病害的应用试验时间：2016年6-7月在安康市农科所温室进行。试验品种：花魔芋供试病原菌菌株：魔芋软腐病病原菌(陕西省微生物研究所分离并保藏)试验设计3个处理：①埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌液(孢子数109cfu/ml)，②市售72％农用链霉素，③清水。预防作用的测定：选取健康、长势均匀的魔芋盆栽苗，分别灌根3个处理的药液，每棵灌根500ml。24h后接种魔芋软腐病病原菌，采用灌根方法接种，将魔芋软腐病病原菌菌液配成105cfu/ml菌液，每棵接种100ml菌液。每个处理3次重复，每重复10棵苗，5d后按分级标准进行病情调查。治疗作用的测定：选取健康、长势均匀的魔芋盆栽苗，接种魔芋软腐病病原菌，采用灌根方法接种，将魔芋软腐病病原菌菌液配成105cfu/ml菌液，每棵接种100ml菌液。24h后分别灌根3个处理的药液，每棵灌根500ml。每个处理3次重复，每重复10棵苗，5d后按分级标准进行病情调查。表3病情严重度分级标准0级长势良好无发病症状1叶梢发黄3叶片部分发黄5叶片全部发黄，萎蔫，植株不倒伏7植株倒伏，茎中空腐烂，有腐臭味病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100,相对防治效果(％)＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100,计算结果用spss软件进行方差分析，清水对照防效记为0，统计结果如下。表4埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂对魔芋软腐病的预防作用表5埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂对魔芋软腐病的治疗作用由结果可见，埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂对魔芋软腐病的预防效果达78.30％，对魔芋软腐病的治疗作用达74.44％，与常用药剂农用链霉素的防治效果相当，可作为替代药剂使用。七、埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂防治魔芋软腐病的大田试验，参见图11。试验时间：2017年3-11月在汉中市农科所魔芋种植基地进行。试验品种：花魔芋供试病原菌菌株：魔芋软腐病病原菌(陕西省微生物研究所分离并保藏)选取100g左右，大小均匀的魔芋种芋下种，种植时按照以下处理进行药剂防治。设计以下处理组：①实验组用埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂原液、10倍稀释液、100倍稀释液分别进行灌根处理，②对照组分别采用清水和72％农用链霉素进行灌根处理。每株灌根100ml，每处理50株，重复3次，正常水肥管理。每月调查病情，记录软腐病发病率，收获期计算软腐病总发病率。8月测量魔芋株高，11月收获时对魔芋块茎进行称重，计算膨大系数。膨大系数＝收获时魔芋块茎重量/种芋重量。表6埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂对魔芋软腐病的大田防治效果菌剂软腐病发病率％全株高cm块茎膨大系数菌剂原液12.5837.728.64菌剂10倍稀释液25.4535.697.43菌剂100倍稀释液32.7933.416.7972％农用链霉素11.7436.157.59清水37.8132.876.12结果见表6，清水对照组软腐病发病率为37.81％，而不同浓度埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂灌根处理后，魔芋软腐病的发病率均有下降，其中施用菌剂原液的发病率最低，为12.58％，与72％农用链霉素效果相当。随着菌剂浓度降低，对魔芋软腐病的防效逐渐减弱。同时，施用埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂后，魔芋全株高，块茎膨大系数等农艺性状均比清水和药剂对照组有所提高。其中菌剂原液全株高37.72cm，块茎膨大系数8.64，清水对照全株高仅为32.87cm，块茎膨大系数6.12，可见埃吉类芽孢杆菌(paenibacilluselgii)swl-w8菌剂促生长效果明显，参见图12，上排为菌剂处理后收获的魔芋块茎，下排为对照处理收获的魔芋块茎。以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。sequencelisting<110>陕西省微生物研究所<120>一种埃吉类芽孢杆菌（paenibacilluselgii）swl-w8及其应用<130>1<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1385<212>dna<213>埃吉类芽孢杆菌swl-w8（paenibacilluselgiiswl-w8）<400>1gaccctttcggggtttagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcctgtaaga60ctgggataactaccggaaacggtagctaagaccggataagtgattctcttgcatgagagg120atcaagaaacacggggcaacctgtggcttacagatgggcctgcggcgcattagctagttg180gtggggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccac240actgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaa300tggacgcaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagc360tctgttgccagggaagaacgtcgtggagagtaactgctctgcgaatgacggtacctgaga420agaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgt480ccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggccgcttaagtctggtgtttaagcccg540aggctcaacctcggttcgcactggaaactgggtggcttgagtgcaggagaggaaagcgga600attccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggc660tttctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagatac720cctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaggtgttaggggtttcgatacccttggt780gccgaagtaaacacaataagcactccgcctggggagtacgctcgcaagagtgaaactcaa840aggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcga900agaaccttaccaggtcttgacatccctctgaatatcctagagatagggtaggccttcggg960acagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaag1020tcccgcaacgagcgcaacccttgaacttagttgccagcattgagttgggcactctaagtt1080gactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatg1140acctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaagcgaagtcgcgagatgga1200gccaatcctaagaaagccggtctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaag1260tcggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggtcttgta1320cacaccgcccgtcacaccacgagagtttacaacacccgaagtcggtggggtaaaccgcaa1380ggagc1385当前第1页12